流式細胞儀分析技術及應用

1、第十七章 流式細胞儀分析技術及應用,第一節(jié) 概述 一、工作原理 二、散射光的測定 三、熒光測量 四、細胞分選原理,第二節(jié) 數(shù)據(jù)的顯示與分析 一、參數(shù) 二、數(shù)據(jù)顯示方式 三、設門分析技術,第三節(jié) 流式細胞儀免疫分析的技術要求一、免疫檢測樣品制備二、免疫分析中常用的熒光染料與標記染色三、免疫膠乳顆粒的應用四、流式細胞免疫學技術的質(zhì)量控制,第四節(jié) 流式細胞術在免疫學檢查中的應用 一、淋巴細胞及其亞

2、群的分析 二、淋巴細胞功能分析 三、淋巴造血系統(tǒng)分化抗原及白血病免疫分型 四、腫瘤耐藥相關蛋白分析 五、AIDS病檢測中的應用 六、自身免疫性疾病相關HLA抗原分析 七、移植免疫中的應用,思考題小結(jié),流式細胞術(flow cytometry, FCM)是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞理化特性進行多參數(shù)定量分析和分選的新技術。,流式細胞術最大的特點是能在保持細胞及細胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被

3、破壞的狀態(tài)下，通過熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號對細胞進行定量分析或純化分選。,細胞不被破壞，測量快速、大量、準確、靈敏、定量,流式細胞術的特點,,流式細胞儀是測量染色細胞標記物熒光強度的細胞分析儀，是在單個細胞分析和分選基礎上發(fā)展起來的對細胞的物理或化學性質(zhì)（如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等）進行快速測量并可分類收集的高技術。,第一節(jié) 概述,,,,流式細胞儀常檢測的細胞特性,采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更

4、好的單色性與激發(fā)效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術結(jié)合的標記技術，保證檢測的靈敏度和特異性；用計算機系統(tǒng)對流動的單細胞懸液中單個細胞的多個參數(shù)信號進行數(shù)據(jù)處理分析，保證了檢測速度與統(tǒng)計分析精確性。,一、工作原理,（1） 液流系統(tǒng) （2） 光學系統(tǒng) （3） 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),1.流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)：,,由樣本和鞘液組成待測細胞 單個細胞的懸液 熒光染料標記的單抗對其染色 受清潔氣體壓力

5、從樣品管進入流動室形成樣本流鞘液：輔助樣本流被正常檢測的基質(zhì)液。主要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。,,,,,（1）液流系統(tǒng),液流系統(tǒng)示意圖,FCM的液流系統(tǒng)（如何形成單個細胞流）,樣本管,,鞘液管,,,激光光源：氣冷式氬離子激光器分色反光鏡：反射長/短波長，通過短/長波長光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光濾片：長通、短通、帶通光電倍增管：FS,

6、 SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（熒光）,（2）光學系統(tǒng),光學系統(tǒng)示意圖,,主要由計算機及其軟件組成,（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),基本工作原理,基本過程,,流式細胞儀與顯微鏡的區(qū)別,細胞在液柱中與激光束相交時向周圍360°立體角方向散射的光線信號，它的強弱與細胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關，主要分為前向散射光和側(cè)向散射光。,二、散射光的測定,,,,前向散射光（forward scatter, FS

7、）：激光束照射細胞時，光以相對軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射的訊號用于檢測細胞等粒子的表面屬性，信號強弱與細胞體積大小成正比。,,,前向散射光示意圖,,側(cè)向散射光（side scatter, SS）：激光束照射細胞時，光以90°角散射的訊號，用于檢測細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。,,側(cè)向散射光示意圖,,測得的FS與SS信號通過計算機處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號對未染色的活細胞進行分析或分選。

8、 此為血細胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。,淋巴細胞,單核細胞,中性粒細胞,光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群,,熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長與激發(fā)光波長不同。每種熒光染料會產(chǎn)生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區(qū)分開，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細胞上的多個不同特征。線性放大器和對數(shù)放

9、大器,三、熒光測量,熒光染料的特性,激發(fā)波長(EXCITING)發(fā)射波長(EMISSION),,,,,,,,熒光補償,通過流式細胞儀進行細胞分選主要是在對具有某種特征的細胞需進一步培養(yǎng)和研究時進行的。,四、細胞分選原理,,,,,,,壓電晶體,產(chǎn)生機械振動,不充電,充電,（一）分選基本原理,,分選速度：單位時間內(nèi)分選的細胞數(shù)量。與懸液中細胞的含量成正比。分選純度：分選出的目的細胞占所有收獲細胞的百分率。分選收獲率：實際收獲的分選細胞

10、與設定通過測量點的分選細胞之間的比率。與純度成反比。分選得率：從一群體細胞懸液中分辨出目的細胞的總量，再經(jīng)分選后得到目的細胞的實際得率。與分選速度成反比。,（二）分選的技術要求,,參數(shù)：FS,SS,FL數(shù)據(jù)顯示方式 （單參數(shù)直方圖 、雙參數(shù)散點圖 、二維等高圖 、假三維等高圖 、三參數(shù)散點圖 ）設門分析技術,第二節(jié) 數(shù)據(jù)的顯示與分析,,FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少,一、

11、 參數(shù),,單參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖:點圖 二維等高圖 假三維等高圖三參數(shù)直方圖多參數(shù)分析,直分析方圖,設門分析:REGION和GATE設置,二、數(shù)據(jù)顯示方式,,由一維參數(shù)(散射光或熒光)與顆粒計數(shù)(COUNT)構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。,（一）單參數(shù)直方圖,單參數(shù)直方圖,,雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細胞的兩個測量參數(shù)，根據(jù)這兩個參數(shù)就可以確定細胞在圖上的表達位置

12、。雙參數(shù)信號通常采用對數(shù)信號，最常用的是點密圖，在圖中，每個點代表一個細胞，點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。,（二）雙參數(shù)直方圖,1.雙參數(shù)直方圖點圖,雙參數(shù)直方圖點圖,2. 二維等高圖,,由類似地圖上的等高線組成，其本質(zhì)也是雙參數(shù)直方圖。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細胞相對或絕對數(shù)，即“等高”。曲線層次越高(越里面的線) 所代表的細胞數(shù)愈多。等高線越密集則表示細胞數(shù)變化率越大。,二維等高圖,3.

13、 假三維等高圖,（三）三參數(shù)直方圖,,多參數(shù)分析：當細胞標記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號和散射光信號可根據(jù)需要進行組合分析。,（四）流式細胞儀的多參數(shù)分析,,,Gate設置：指在某一張選定參數(shù)的直方圖上，根據(jù)該圖的細胞群分布選定其中想要分析的特定細胞群，并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細胞的分布情況。,根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。,三、設門分析技術,A 淋巴細胞

14、B 單核細胞C 中性粒細胞,A、B、C均為任意門,線性門,,Region設置: 區(qū)閾（region, R）與門(gate, G ) 是兩個相關的概念，區(qū)閾可與門對應，但是也可以包含于門。,D1 CD4+/CD3-D2 CD4+/CD3+D3 CD4- /CD3-D4 CD4- /CD3+,如十字門分析時，起就可以由四個區(qū)域構(gòu)成，即G=D1+D2+D3+D4。,,樣本制備標記染色液相芯片技術 質(zhì)量控制,第四節(jié)

15、流式細胞儀免疫分析的技術要求,,外周血淋巴細胞樣品的制備分離單個核細胞培養(yǎng)細胞的樣品制備 蛋白酶消化 機械吹打 使貼壁細胞脫落 洗滌 尼龍網(wǎng)過濾,,,,,一、免疫檢測樣品制備,,,新鮮實體組織單細胞懸液的制備機械法酶處理法化學試劑處理法表面活性劑處理法單細胞懸液的保存深低溫保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（2周）甲醛或多聚甲醛保存法（2月）,,適用條件:有較高的量子產(chǎn)額

16、和消光系數(shù)對488nm的激發(fā)光波長有較強的吸收發(fā)射光波長與激發(fā)光波長間有較大的波長差易與標記單抗結(jié)合而不影響抗體的特異性,二、常用的熒光染料與標記染色,,激光,細胞懸液,異硫氰酸熒光素,得州紅,能量傳遞復合染料,藻膽蛋白類,（一）幾種常見的熒光染料,常用的幾類熒光染料,,用化學法將兩種不同激發(fā)波長的染料結(jié)合在一起，在488nm激發(fā)光照射下，通過一個熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長再激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒光信號，從而檢測到該特定熒光信

17、號。,能量傳遞復合染料,,,488nm,575nm,670nm紅色熒光,花青苷5,藻紅蛋白,能量傳遞復合染料機制,,,熒光染料與細胞成分的四種結(jié)合方式結(jié)構(gòu)親和式嵌入結(jié)合共價鍵結(jié)合熒光標記抗體特異性結(jié)合免疫熒光標記方法直標:干擾少,但需購買多種單抗間標:步驟多,干擾多,不需標記多種抗體組合標記,（二）免疫熒光標記,,免疫膠乳顆粒的應用即液相芯片技術是把微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光

18、色，把針對不同檢測物的乳膠微球混合后再加入待標本，在懸液中與微粒進行特異性地結(jié)合，經(jīng)激光照射后不同待測特產(chǎn)生不同顏色，并可進行定量分析。因檢測速度極快，所以又有“液相芯片”之稱 。,三、免疫膠乳顆粒技術的應用,,微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色（固相芯片是用探針在芯片上的坐標位置給基因的特異性編碼；而液相芯片則是用顏色來編碼）,通過對標記不同熒光素分子的檢測，實現(xiàn)FCM對可溶性物質(zhì)的定量分析,,適當?shù)闹苽浞绞教幚砑t細胞實體組

19、織來源標本用機械法溫度25~37℃，pH7.0~7.2,四、流式細胞免疫學技術的質(zhì)量控制,（一）單細胞懸液制備的質(zhì)控,溫度pH染料濃度固定劑,（二）免疫熒光染色的質(zhì)控,,光路與流路校正: 確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，減少變異（CV）。PMT（光電倍增管）校準: 保證樣品檢測時儀器處于最佳靈敏度工作狀態(tài)。絕對計數(shù)校準: 保證計數(shù)的準確性。,Flow-check,Flow-set,Flow-count,（三）儀器操作的

20、質(zhì)控,,同型對照：即免疫熒光標記中的陰性對照，選用相同源性的未標記單抗作為對照調(diào)整和設置電壓，以保證特異性。全程質(zhì)量控制：與待測標本一起標記和檢測，結(jié)果達靶值，提示本次實驗結(jié)果可靠。,（四）免疫檢測的質(zhì)控,流式細胞術目前已廣泛地被應用于免疫學基礎研究和逐步進入臨床應用各方面，用流式細胞儀對細胞表面的抗原成分進行標記分析，可區(qū)別多種細胞的特性，為細胞免疫的研究增加了有效的手段和幫助。,第四節(jié) 在免疫學檢驗中的應用,,T淋巴細胞及其亞群

21、分析Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴細胞及其亞群分析B1(CD19+CD5+):產(chǎn)生IgM型自身抗體, 參與免疫調(diào)節(jié)、與自身免疫病的發(fā)生有關B2(CD19+CD5-):受外來抗原刺激, 產(chǎn)生高親和性特異性抗體NK細胞分析NK(CD3-CD16+CD56+),一、淋巴細胞及其亞群的分析,,,細胞介導細胞毒性試驗(死細胞與活細胞比例)細胞內(nèi)細胞因子測定,二、淋巴細胞功能分析

22、,三、淋巴造血系統(tǒng)及白血病免疫分型,對淋巴瘤和白血病進行多色免疫分型用于選擇化療方案、判斷預后及檢出微小殘留病變,,,CD4+Th細胞、CD4+/CD8+比例,MDR(+)表示對化療藥物耐藥,四、腫瘤耐藥基因分析,五、AIDS病檢測中的應用,,HLA-B27可出現(xiàn)在58%～97%的強直性脊椎炎(As) 患者,六、自身免疫病相關HLA抗原分析,,FCM作為一個強大的技術平臺，已應用于多個領域，其在移植免疫分析中的應用也越來越廣泛。目前移

23、植免疫中的FCM應用主要包括流式細胞術的交叉配型（Flow cytometry cross-matching, FCXM）和群體反應性抗體（Panel reactive antibody, PRA）檢測。,七、移植免疫中的應用,思考題,流式細胞儀的分析檢測原理是什么？流式細胞儀分析中前向散射光、側(cè)向散射光和熒光的檢測意義。何謂熒光補償？何謂“液相芯片”技術？細胞分選的基本原理。FCM分析中有哪些數(shù)據(jù)顯示方式，如何解讀結(jié)果及其設門

24、分析的意義？如何進行FCM分析檢測樣品的制備？流式細胞分析前如何驗證儀器工作狀態(tài)，采用何種校正物？流式細胞免疫分析的質(zhì)量控制包括哪些方面？流式細胞術有哪些臨床應用價值？流式細胞儀分析中常見的熒光素有那些？他們的特性如何？,小 結(jié),流式細胞術（FCM）是在保持細胞及細胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，從分子水平上獲取多種信號實現(xiàn)對單個細胞進行定量分析或純化分選。FCM分析中前向散射光反映顆粒的大??；側(cè)向散射光反映顆粒內(nèi)