流式細(xì)胞儀原理及應(yīng)用

1、流式細(xì)胞儀原理 及其應(yīng)用,,流式細(xì)胞儀的原理,,流式細(xì)胞術(shù)的基本概念,流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, 簡稱FCM）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且同時檢測單個微粒（通常是細(xì)胞）的多項(xiàng)特性，并加以定量的技術(shù)，同時可以對特定群體加以分選;研究對象多為生物顆粒，如各種細(xì)胞、微生物及人工合成微球等；研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量。,流式細(xì)胞術(shù)的基本概念,CD:是cluster of differentia

2、tion 的縮寫，指的是分化群或分化簇，即將來自不同實(shí)驗(yàn)室的單克隆抗體所識別的同一分化抗原歸為一個分化群，每一CD分子代表一種或一類分化抗原。Antibody：抗體是能與抗原特異性結(jié)合并具有免疫活性的球蛋白。它一般是由抗原刺激B細(xì)胞分化成漿細(xì)胞后產(chǎn)生的?？贵w分子具有結(jié)合部位(結(jié)合簇)，能與對應(yīng)的抗原決定簇結(jié)合。抗體與不同的抗原結(jié)合往往出現(xiàn)不同的反應(yīng)，因而常給抗體以不同的名稱，如凝集素、沉淀素、抗毒素、溶血素、溶菌素等。,流式細(xì)胞術(shù)的基

3、本概念,Fluorescein ：熒光素，是指在一定波長的電磁波（常為藍(lán)光或紫外光）照射下能發(fā)出熒光的一類染料 ；常見的熒光素有異硫氰酸熒光素 ( fluorescein isothiocyanate, FITC)、藻紅蛋白（R-Phycoerythrin,R-PE）、別藻青蛋白（allophycocyanin,APC）、多甲藻葉綠素蛋白（ peridinin chlorophyll protein, PerCP）等。,流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)

4、,極短時間內(nèi)可分析大量細(xì)胞，只要標(biāo)本中的細(xì)胞數(shù)量足夠，流式細(xì)胞儀（Flow cytometer）可以每秒鐘數(shù)十、數(shù)百、數(shù)千個細(xì)胞的速率進(jìn)行測量，測量的細(xì)胞總數(shù)可達(dá)數(shù)千、數(shù)萬乃至數(shù)百萬個。 可同時分析單個細(xì)胞的多種特征，當(dāng)同時用多種分子探針，如用不同熒光素標(biāo)記的不同單克隆抗體進(jìn)行多色熒光染色，通過流式細(xì)胞分析，即可獲得單細(xì)胞的多種信息，使細(xì)胞亞群的識別、計數(shù)更為準(zhǔn)確。定性或定量分析細(xì)胞：通過熒光染色對單細(xì)胞的某些成分如DNA含量、抗原

5、或受體表達(dá)量、Ca2+濃度、酶活性以及細(xì)胞的功能等均可進(jìn)行單細(xì)胞水平的定性與定量分析 強(qiáng)大的分選功能，在分析的同時可以對特定群體加以分選,流式細(xì)胞儀的檢測范圍,細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞粒度細(xì)胞表面面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量,細(xì)胞功能細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子酶活性激素結(jié)合位點(diǎn)細(xì)胞受體,當(dāng)前流式細(xì)胞分析發(fā)展趨勢,從相對細(xì)胞計數(shù)到絕對細(xì)胞計數(shù) 從相對定量到絕對定量

6、分析從單色到多色熒光分析 從細(xì)胞膜成分到細(xì)胞內(nèi)成分分析從細(xì)胞分析到可溶性成分的流式細(xì)胞分析,光學(xué)系統(tǒng)鞘流系統(tǒng)電子系統(tǒng)計算機(jī)系統(tǒng)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換處理系統(tǒng),流式細(xì)胞儀的組成,光學(xué)系統(tǒng)：,激發(fā)光源：弧光燈和激光兩大類激光優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定性好、能量高、發(fā)散角??；激光分類：氣體激光器、染料激光器、半導(dǎo)體激光器氣體激光器：氬離子激光（488nm） 氪離子激光（647nm） 氦-氖激光（6

7、33nm）FACSCaliburTM 采用了氬離子激光（488nm）和波長為635nm的半導(dǎo)體激光器。,光信號檢測 散射光信號,Right Angle Light Detector ? Cell ComplexitySSC,Forward Light Detector ? Cell Surface Area FSC,Incident Light Source,,,,,,,,,,,,,

8、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,前向角散射光（FSC, Forward Scatter）細(xì)胞相對大小及其表面積 側(cè)向角散射光（SSC, Side Scatter）細(xì)胞粒度及細(xì)胞內(nèi)相對復(fù)雜性,Laser,FALS Sensor,光信號檢測,熒光信號使用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量,光信號檢測常見熒光染料的發(fā)射波長,,,光信號收集,分光鏡濾光鏡：長通（

9、LP） 短通（SP） 帶通（BP）光電信號轉(zhuǎn)換：光電倍增管（PMT） 光電二極管,熒光補(bǔ)償原理,顏色補(bǔ)償：采用合適的方法校正熒光染料之間疊加所造成的誤差。在完成雙色以上熒光標(biāo)記的樣本時，都需要作顏色補(bǔ)償。帶通濾片接受的是一定帶寬波長的熒光，故會有干擾光同時被接收，然后一同進(jìn)入PMT進(jìn)行光電轉(zhuǎn)換并放大。通常干擾光占該染料所發(fā)出熒光總量的X%,補(bǔ)償模型圖,鞘流系統(tǒng)

10、 流動室,鞘液,,鞘流原理 鞘流公式,Re= dρv／η Re為雷諾（Reynolds）系數(shù)，d 為管道直徑，v 為液體流速，密度為ρ ，黏滯系數(shù)為η。 當(dāng)Re<2300時，液體處于穩(wěn)流狀態(tài)， 當(dāng)Re ﹥2300時，液體處于湍流狀態(tài)。,數(shù)據(jù)處理分析轉(zhuǎn)換,數(shù)據(jù)存儲: LIST MODE,數(shù)據(jù)顯示: 直方圖 ( Histogram )二維點(diǎn)圖(

11、Dot Plot)等高線圖(Contour Plot)密度圖 (Density)三維圖（3D Plot）等,外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖（紅細(xì)胞溶解后）,熒光信號,雙色直接染色,數(shù)據(jù)分析,直方圖分析,數(shù)據(jù)分析,點(diǎn)圖分析,數(shù)據(jù)分析,等高圖和密度圖分析,數(shù)據(jù)分析,三維圖分析,當(dāng)前生產(chǎn)流式細(xì)胞儀的公司,BD公司貝克曼-庫爾特公司Cytomation公司Bio-Rad 公司Partec公司（德國）Applied Bios

12、ystems公司,BD公司簡介,BD公司是由Maxwell W. Becton和Fairleigh S. Dickinson 于1897年在紐約創(chuàng)立的,總部位于美國新澤西州,BD公司流式細(xì)胞儀產(chǎn)品,FACSCount流式細(xì)胞儀,FACSCalibur流式細(xì)胞儀,FACSCanto流式細(xì)胞儀,BD公司流式細(xì)胞儀產(chǎn)品,FACS Vantage SE-大型分選機(jī),FACS Aria-高速分選的臺式機(jī),FACS Diva 高速分選的數(shù)字化大型機(jī)

13、,貝克曼-庫爾特公司流式細(xì)胞儀產(chǎn)品,FC 500 全自動分析儀,,,,Gallios 雙激光6色,EPICS ALTRA分析分選系統(tǒng),AppliedBiosystems公司,AttuneTM 聲波聚焦細(xì)胞分析儀,流式細(xì)胞儀的應(yīng)用,細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外發(fā)生了什么事件？,流式細(xì)胞儀的應(yīng)用領(lǐng)域,臨床研究:血液、腫瘤、藥理、免疫….生物學(xué)研究：遺傳、生殖、微生物、細(xì)胞生物、毒理、分子生物、….環(huán)境研究：海洋生態(tài)研究….制藥工業(yè)食品工業(yè)

14、農(nóng)業(yè)畜牧業(yè),流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用,HIV免疫分型，CD4絕對計數(shù)白血病和淋巴瘤的免疫分型腫瘤的細(xì)胞周期和倍體分析細(xì)胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測干細(xì)胞計數(shù)殘量白血病細(xì)胞檢查HLA-B27檢查血小板功能及相關(guān)疾病,流式細(xì)胞儀的臨床免疫學(xué)應(yīng)用,淋巴細(xì)胞免疫分型淋巴細(xì)胞亞群分析CD4絕對計數(shù)HIV與SARS的診斷與研究淋巴細(xì)胞CD4/CD8分析CD4絕對計數(shù)T細(xì)胞活化,細(xì)胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測免疫功能和免疫

15、調(diào)控的研究淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的活化細(xì)胞因子的研究淋巴細(xì)胞的增殖樹突狀細(xì)胞的研究HLA-B27檢測,淋巴細(xì)胞亞群分析,淋巴細(xì)胞亞群分析,使用經(jīng)熒光素標(biāo)記的特異單克隆抗體，進(jìn)行多色染色，同時對淋巴細(xì)胞膜上多種白細(xì)胞分化抗原（CD分子）的表達(dá)進(jìn)行分析，可以將淋巴細(xì)胞亞群區(qū)分開，并定性分析；淋巴細(xì)胞亞群的百分含量淋巴細(xì)胞亞群的絕對計數(shù)，進(jìn)行定量分析,臨床意義,了解在不同情況下體內(nèi)免疫功能狀態(tài)輔助臨床疾病的診斷探索疾病的發(fā)病機(jī)理

16、、病程、預(yù)后監(jiān)測、指導(dǎo)臨床治療方案免疫系統(tǒng)疾病免疫缺陷病，AIDS移植病人排斥反應(yīng)或移植物抗宿主反應(yīng)的檢測腫瘤病人化療后免疫力檢測,淋巴細(xì)胞亞群分析,根據(jù)功能，淋巴細(xì)胞主要分為B淋巴細(xì)胞（CD19+），與體液免疫有關(guān)T淋巴細(xì)胞（CD3+），與細(xì)胞免疫有關(guān)總T和總B可以用來判斷某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NK細(xì)胞（CD3-CD16+56+），行使免疫監(jiān)控功能，  能夠介導(dǎo)對某些腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞毒性

17、作用。,淋巴細(xì)胞亞群分析,根據(jù)CD4、CD8表達(dá)，T淋巴細(xì)胞又分為T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞（CD3+CD4+）T抑制/細(xì)胞毒性細(xì)胞（CD3+CD8+）Th/Ts 評價那些自身免疫失調(diào)或被懷疑是免疫失調(diào)或已知患有免疫缺陷的病人的免疫狀態(tài)，此外，這一比值還可用來監(jiān)測骨髓移植病人以免受到急性GVHD的攻擊 Th/Ts升高：自身免疫性疾?。愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、SLE） Th/Ts降低：病毒感染、惡性腫瘤、再生障礙性貧血,常見疾病的T 淋巴細(xì)

18、胞的變化：,疾病 CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 ? （活動期） ? ? 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 - 或? （活動期） ? ? ? 多發(fā)性硬化癥

19、 ? 重癥肌無力 ? ? 膜型腎小球腎炎 ? ? 胰島素依賴性糖尿病

20、 ? ? 乙型肝炎 ?自身溶血性貧血 ? ? 上呼吸道感染 ?

21、 ? ?,常見疾病的T 淋巴細(xì)胞的變化,CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ 腫瘤 ? ? ? ? ? ? ? ? 再障及粒細(xì)胞減少癥 ?

22、 ? ?巨細(xì)胞病毒感染 ? ? ? 血小板減少 ? ? ? ? ? ? 活動性特應(yīng)性皮炎 ? ? ?

23、 ?過敏性皮炎 ? ? ?,淋巴細(xì)胞亞群雙色分析,,,,,,,12%,76%,49%,26%,11%,AIDS 病人T亞群分析,27-51%,15-44%,,,,50-84%,先天性無 r 球蛋白血癥,5-18%,,乳腺癌患者T淋巴細(xì)胞亞群變化,TriTEST/MultiTest與T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù),使用三色試劑或四色免

24、洗試劑樣本使用EDTA抗凝全血，用血量50uL免洗操作，減少細(xì)胞丟失絕對計數(shù)TruCOUNT管預(yù)先加有已知數(shù)量微球，在流式細(xì)胞儀上直接得到T淋巴細(xì)胞亞群的絕對含量，提高工作效率和計數(shù)的精確度——單平臺計數(shù)MultiSET全自動淋巴細(xì)胞亞群軟件進(jìn)行樣本獲取和分析MultiSET軟件自動做質(zhì)量檢查，幫助發(fā)現(xiàn)樣本運(yùn)輸、處理等過程中造成的錯誤醫(yī)生報告T淋巴細(xì)胞及TH、TS百分含量、絕對含量和H/S比值，并報告參考值范圍,TriTES

25、T CD4/CD8/CD3分析與T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù),%T LymphCD3+ Abs CntCD3+CD4+ %T LymphCD3+CD4+ Abs CntCD3+CD8+ %T LymphCD3+CD8+ Abs CntT H/S Ratio,MultiTEST CD3/CD8/CD45/CD4,MultiTEST CD3/CD15+56/CD45/CD19,HLA-B27分析,HLA-B27,? HLA-B

26、27是MHC I類抗原，在有核細(xì)胞上廣泛表達(dá)? HLA-B27的表達(dá)與強(qiáng)直性脊柱炎高度相關(guān)，在其它血清陰性骨關(guān)節(jié)病、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、葡萄膜炎等也有明顯表達(dá)? 使用流式細(xì)胞儀，可以快速、靈敏、準(zhǔn)確地分析HLA-B27? BD HLA-B27 Kit檢測HLA-B27，報告檢測的平均熒光強(qiáng)度，根據(jù)界值判定，得到陰性/陽性結(jié)果。實(shí)驗(yàn)的靈敏度為100%，特異性為97.5%,HLA-B27,HLA-B27陰性樣本,HLA-B27陽性樣本,,

27、,流式細(xì)胞術(shù)在臨床血液學(xué)中的應(yīng)用,流式細(xì)胞儀的臨床血液學(xué)應(yīng)用,白血病和淋巴瘤免疫分型殘留白血病造血干細(xì)胞計數(shù)網(wǎng)織紅細(xì)胞的分析陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿（PNH）診斷血小板分析血小板膜糖蛋白分子的表達(dá)血小板活化網(wǎng)織血小板分析血小板自身抗體檢測網(wǎng)織血小板計數(shù),白血病免疫分型,FAB分型：AL分為AML（M0-M7）& ALL白血病的MICM分型 Morphology Immunology Cytogen

28、etics Moleculor Genetics 白血病分型是選擇化療方案和判斷預(yù)后的重要依據(jù)。白血病免疫分型是MICM分型的重要組成部分，也是對FAB分型的補(bǔ)充，對白血病的診斷、治療策略制定、預(yù)后判斷及對白血病發(fā)病機(jī)制的研究都具有重要作用。,白血病細(xì)胞特性：,白血病細(xì)胞的異常表現(xiàn)在抗原系列異常和時間異常 異常的抗原表達(dá)(Aberration Antigen Expression) 喪失系

29、列規(guī)律性（lineage infidelity) 過高，過低，不表達(dá)， 交叉 喪失分化發(fā)育的階段性（differentiation asynchrony) 早期與晚期抗原同表達(dá),白血病免疫分型抗原,常用白血病細(xì)胞系列與分化階段抗原,白血病細(xì)胞系列非特異性抗原：干/祖細(xì)胞：CD34+、HLA-DR+、CD38-原始細(xì)胞：CD34+、HLA-DR

30、+、CD38+幼稚細(xì)胞：CD34-、HLA-DR-、CD38+）,白細(xì)胞共同抗原：CD45,CD45-SSC的臨床應(yīng)用,CD45是白細(xì)胞的共同抗原成分。所有人類白細(xì)胞均表達(dá)CD45，包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、多形核細(xì)胞、嗜酸、嗜堿性細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞、扁桃腺細(xì)胞以及骨髓前體細(xì)胞。造血系統(tǒng)細(xì)胞CD45表達(dá)量與細(xì)胞分化程度的高低緊密相關(guān)，即分化程度高的細(xì)胞CD45表達(dá)量高，分化程度低的細(xì)胞CD45表達(dá)量低（淋巴細(xì)胞>單核細(xì)胞>

31、;成熟粒細(xì)胞>原幼細(xì)胞，在紅細(xì)胞中不表達(dá)；SSC是側(cè)向角參數(shù)，反應(yīng)細(xì)胞的顆粒度（成熟粒細(xì)胞>單核細(xì)胞>原幼細(xì)胞>淋巴細(xì)胞）。目前，國際上采用CD45—SSC設(shè)門（Gating），可非常輕松地將白血病細(xì)胞與正常細(xì)胞分開，增加白血病免疫分型的準(zhǔn)確性。,CD45的臨床應(yīng)用,用CD45-SSC設(shè)門尋找異常細(xì)胞，將細(xì)胞分為5個群體，當(dāng)幼稚細(xì)胞達(dá)70-80%時，即可大致估計AL的類型。骨髓成分復(fù)雜，各種大小和分化程度的細(xì)胞均

32、有，若不用CD45-SSC設(shè)門，我們檢測到的陽性細(xì)胞的百分率是以總細(xì)胞為分母來計算，當(dāng)時以陽性細(xì)胞大于20%為界線，現(xiàn)在以CD45-SSC設(shè)門，排除了正常細(xì)胞的干擾，陽性細(xì)胞的百分率是以幼稚細(xì)胞為分母，因此再以陽性細(xì)胞>20%作界線則不太合適了，所以，用CD45-SSC設(shè)門尋找異常細(xì)胞時，以定性比定量更重要。,正常人血液白細(xì)胞免疫表型散點(diǎn)圖,,,正常人血液細(xì)胞免疫表型,T淋巴細(xì)胞：CD45++++、CD3+/CD4+、CD3+/C

33、D8+、CD5+/CD7+，部分細(xì)胞CD（16+56）+，無CD4+CD8+雙陽性細(xì)胞B淋巴細(xì)胞：CD45++++、CD10-/CD19+、CD20+/CD22+、HLA-DR+/CD13-NK細(xì)胞：CD45++++ 、CD（16+56）+/CD3-單核細(xì)胞：CD45+++、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+中性粒細(xì)胞：CD45++、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比CD33表達(dá)更高

34、嗜酸性粒細(xì)胞：CD45+++、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比CD33表達(dá)更高,,,正常人骨髓有核細(xì)胞免疫表型散點(diǎn)圖,正常人骨髓細(xì)胞免疫表型,淋巴細(xì)胞:CD45++++、CD34-/CD38+、CD5+/CD7+（T淋巴細(xì)胞）；CD10-/CD19＋（B淋巴細(xì)胞）單核細(xì)胞:CD45+++,CD34-/CD38+、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+、CD36+/GlyA-粒系細(xì)胞:原粒細(xì)

35、胞CD45+、CD34+/CD38+、CD14-/CD33+、HLA-DR+/CD13+早幼粒細(xì)胞及其以下各階段中性粒細(xì)胞：CD45++、CD34-/CD38+、CD14-/CD33+、HLA-DR-/CD13+，與原粒細(xì)胞或更幼稚細(xì)胞的表型有明顯差異巨核細(xì)胞：CD45++、CD41+/CD61+幼紅細(xì)胞：CD45-、CD36+/GlyA+,AML免疫表型,急性T淋巴細(xì)胞白血病（T-ALL）骨髓細(xì)胞免疫分型散點(diǎn)圖,,,,,,,,

36、急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋML-M3）骨髓細(xì)胞免疫分型散點(diǎn)圖,,,,,FCM在臨床白血病分型中的作用,▲能正確區(qū)別AML和ALL，并能進(jìn)一步區(qū)別ALL中的T系和B系及亞型▲能正確鑒別AML中難于鑒別的M0、M6、M7▲診斷雙系或雙表型白血病▲發(fā)現(xiàn)僅表達(dá)個別次要非本系列相關(guān)抗原的白血病▲診斷少見疑難白血?。ㄈ鏗CL）,免疫分型 對下列情況具有重要意義,用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)染色不能肯定細(xì)胞來源的白血病。形態(tài)學(xué)為急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋL

37、L）或急性未分化白血病（AUL）但缺乏特異性淋巴細(xì)胞系列抗原標(biāo)記。混合性白血病。部分髓系白血病。目前，免疫分型對粒-單核細(xì)胞和單核細(xì)胞白血病的鑒別尚有一定困難。慢性淋巴細(xì)胞白血病。微小殘留白血病。,陣發(fā)性血紅蛋白尿(PNH),陣發(fā)性血紅蛋白尿是由于紅細(xì)胞膜的獲得性缺陷，對激活補(bǔ)體異常敏感的一種慢性血管內(nèi)溶血患者體內(nèi)紅細(xì)胞呈不均一性利用流式細(xì)胞術(shù)和CD55和CD59單克隆抗體，對PNH患者紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和血小板進(jìn)行分析，證實(shí)存

38、在膜蛋白表達(dá)缺陷的血細(xì)胞，并計算缺陷細(xì)胞在全血中所占比例,陣發(fā)性血紅蛋白尿PNH,正常人紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和血小板CD59表達(dá)完全陽性PNH患者血細(xì)胞分為三型：Ⅰ型：CD59表達(dá)完全陽性，熒光強(qiáng)度與正常人陽性峰熒光強(qiáng)度接近Ⅱ型：CD59表達(dá)部分陽性，熒光強(qiáng)度介于Ⅰ型與Ⅲ型之間 Ⅲ型：CD59表達(dá)完全陰性分析PNH患者各型細(xì)胞所占百分比，評估疾病的嚴(yán)重程度,紅細(xì)胞 —PNH分析,A 正常人B –D 病人,造血干細(xì)胞計數(shù),?造

39、血干細(xì)胞是一群有一定增生能力，可以多向分化的造血細(xì)胞。?造血干細(xì)胞的特征是：?大?。‵SC）和顆粒度（SSC）介于成熟淋巴細(xì)胞、大淋巴細(xì)胞相似?細(xì)胞內(nèi)含有較多核酸物質(zhì)? CD34表達(dá)弱陽性或強(qiáng)陽性? CD45表達(dá)弱陽性?在干細(xì)胞移植時需要做造血干細(xì)胞絕對計數(shù),造血干細(xì)胞計數(shù),血小板檢測,血小板膜糖蛋白復(fù)合物診斷血小板缺陷性疾病CD41-CD61復(fù)合物：血小板無力癥CD42a-CD42b 復(fù)合物：巨大血小板癥血小

40、板活化的相關(guān)檢查血小板顆粒膜糖蛋白，如CD62，CD63血小板膜糖蛋白活化表位，如PAC-1血小板減少性疾病血小板自身抗體檢測網(wǎng)織血小板的檢測血小板脫落微粒的檢測,血小板活化,IIb/IIIa復(fù)合物（CD41/CD61）在所有靜止和活化的血小板上都有表達(dá)血小板活化時發(fā)生的改變IIb/IIIa復(fù)合物發(fā)生變構(gòu)，表達(dá)PAC-1血小板內(nèi)顆粒釋放，分泌促進(jìn)凝血反應(yīng)的物質(zhì)，這時表達(dá)CD62P,CD61圈血小板門P

41、AC-1/?1：陰性對照，靜止的血小板PAC-1/CD62P：試驗(yàn)管，ADP刺激下活化的血小板，報告血小板活化百分含量,血小板活化,,,腦栓塞病人血小板活化檢測,A CD61-SSC設(shè)分析門B 陰性對照C 治療前 PAC-I 27.74%CD62P 15.86%D 溶栓后 PAC-I 9.13%CD62P 4.12%,,血小板活化的意義,直接測量循環(huán)血小板活化狀態(tài)與反應(yīng)性可直接測定凝血酶等誘導(dǎo)劑活化的血小板血小

42、板活化與臨床的關(guān)系：監(jiān)測血小板活化相關(guān)疾病過程，抗血小板藥物療效或治療藥物的影響，預(yù)測血栓形成心肌缺血（心絞痛、心肌梗塞）與血小板活化有關(guān)預(yù)測冠狀動脈成形術(shù)后發(fā)生急性缺血事件的危險性缺血性腦血管病與血小板活化有關(guān)子癇前期、外周血管疾病等均有血小板活力增加抗血小板治療療效監(jiān)測,血小板無力癥（CD41缺陷，PAC-I下調(diào)）,藍(lán)—陰性對照綠—病人紅—正常人,巨血小板癥,藍(lán)—陰性對照綠—正常人紅—病人CD41表達(dá)上調(diào)CD4

43、2a/CD42b缺失,血小板自身抗體 — ITP病人,流式細(xì)胞儀的科研應(yīng)用,免疫功能研究樹突細(xì)胞研究干細(xì)胞研究癌癥病人的多藥耐藥性細(xì)胞動力學(xué)功能研究血小板分析（心血管疾?。┉h(huán)境微生物分析分子生物學(xué)研究,Cytometric Beads Array CBA系統(tǒng),簡介,CBA：流式微球陣列又稱液相多重蛋白定量技術(shù)，是指用一系列熒光強(qiáng)度不同的微球，將可溶性微粒進(jìn)行捕獲并檢測的流式技術(shù)。每個CBA微球在FL3有特

44、定的熒光強(qiáng)度，大小一致，包被有適用于特定分析（如其他抗體或可溶性蛋白）的特異性抗體，提供了類似ELISAs孔板的捕獲表面。簡而言之，將包被有不同抗體的微球混合在一個樣本中即可進(jìn)行多參數(shù)檢測。這種技術(shù)可大大節(jié)約樣本用量，避免ELISAs分析時對樣本過度稀釋導(dǎo)致分析靈敏度的降低。,CBA原理,操作步驟,檢測物與捕獲微球共孵育;洗滌;標(biāo)記熒光探測試劑（FITC或PE標(biāo)記）;洗滌;流式細(xì)胞儀檢測;CBA分析軟件批量數(shù)據(jù)分析。,CBA分

45、析軟件,,,CBA技術(shù),,能夠同時對單個樣本進(jìn)行多種檢測。較傳統(tǒng)檢測大大節(jié)省樣本量。與ELISAs相比靈敏度高、重復(fù)性好。所有分析只需一組標(biāo)準(zhǔn)曲線。避免酶聯(lián)反應(yīng)所致人工假象。節(jié)省操作時間。節(jié)省檢測時間。,與傳統(tǒng)的ELISAs檢測相比,細(xì)胞凋亡,細(xì)胞膜分析-PS外翻（建議用于懸浮細(xì)胞） PS（磷脂酰絲氨酸）正常暴露在胞膜的內(nèi)表面，凋亡時，PS外翻向細(xì)胞外表面。重組蛋白Annexin-V可與PS結(jié)合,Annexin V A