流式細胞儀原理及應用

1、流式細胞儀原理 及其應用,,流式細胞儀的原理,,流式細胞術的基本概念,流式細胞術（Flow Cytometry, 簡稱FCM）是一種可以快速、準確、客觀，并且同時檢測單個微粒（通常是細胞）的多項特性，并加以定量的技術，同時可以對特定群體加以分選;研究對象多為生物顆粒，如各種細胞、微生物及人工合成微球等；研究的微粒特性包括多種物理及生物學特征，并加以定量。,流式細胞術的基本概念,CD:是cluster of differentia

2、tion 的縮寫，指的是分化群或分化簇，即將來自不同實驗室的單克隆抗體所識別的同一分化抗原歸為一個分化群，每一CD分子代表一種或一類分化抗原。Antibody：抗體是能與抗原特異性結合并具有免疫活性的球蛋白。它一般是由抗原刺激B細胞分化成漿細胞后產(chǎn)生的?？贵w分子具有結合部位(結合簇)，能與對應的抗原決定簇結合?？贵w與不同的抗原結合往往出現(xiàn)不同的反應，因而常給抗體以不同的名稱，如凝集素、沉淀素、抗毒素、溶血素、溶菌素等。,流式細胞術的基

3、本概念,Fluorescein ：熒光素，是指在一定波長的電磁波（常為藍光或紫外光）照射下能發(fā)出熒光的一類染料 ；常見的熒光素有異硫氰酸熒光素 ( fluorescein isothiocyanate, FITC)、藻紅蛋白（R-Phycoerythrin,R-PE）、別藻青蛋白（allophycocyanin,APC）、多甲藻葉綠素蛋白（ peridinin chlorophyll protein, PerCP）等。,流式細胞術的特點

4、,極短時間內可分析大量細胞，只要標本中的細胞數(shù)量足夠，流式細胞儀（Flow cytometer）可以每秒鐘數(shù)十、數(shù)百、數(shù)千個細胞的速率進行測量，測量的細胞總數(shù)可達數(shù)千、數(shù)萬乃至數(shù)百萬個。 可同時分析單個細胞的多種特征，當同時用多種分子探針，如用不同熒光素標記的不同單克隆抗體進行多色熒光染色，通過流式細胞分析，即可獲得單細胞的多種信息，使細胞亞群的識別、計數(shù)更為準確。定性或定量分析細胞：通過熒光染色對單細胞的某些成分如DNA含量、抗原

5、或受體表達量、Ca2+濃度、酶活性以及細胞的功能等均可進行單細胞水平的定性與定量分析 強大的分選功能，在分析的同時可以對特定群體加以分選,流式細胞儀的檢測范圍,細胞結構細胞大小細胞粒度細胞表面面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質含量,細胞功能細胞表面/胞漿/核的特異性抗原細胞活性細胞內細胞因子酶活性激素結合位點細胞受體,當前流式細胞分析發(fā)展趨勢,從相對細胞計數(shù)到絕對細胞計數(shù) 從相對定量到絕對定量

6、分析從單色到多色熒光分析 從細胞膜成分到細胞內成分分析從細胞分析到可溶性成分的流式細胞分析,光學系統(tǒng)鞘流系統(tǒng)電子系統(tǒng)計算機系統(tǒng)數(shù)據(jù)轉換處理系統(tǒng),流式細胞儀的組成,光學系統(tǒng)：,激發(fā)光源：弧光燈和激光兩大類激光優(yōu)點：穩(wěn)定性好、能量高、發(fā)散角小；激光分類：氣體激光器、染料激光器、半導體激光器氣體激光器：氬離子激光（488nm） 氪離子激光（647nm） 氦-氖激光（6

7、33nm）FACSCaliburTM 采用了氬離子激光（488nm）和波長為635nm的半導體激光器。,光信號檢測 散射光信號,Right Angle Light Detector ? Cell ComplexitySSC,Forward Light Detector ? Cell Surface Area FSC,Incident Light Source,,,,,,,,,,,,,

8、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,前向角散射光（FSC, Forward Scatter）細胞相對大小及其表面積 側向角散射光（SSC, Side Scatter）細胞粒度及細胞內相對復雜性,Laser,FALS Sensor,光信號檢測,熒光信號使用熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量,光信號檢測常見熒光染料的發(fā)射波長,,,光信號收集,分光鏡濾光鏡：長通（

9、LP） 短通（SP） 帶通（BP）光電信號轉換：光電倍增管（PMT） 光電二極管,熒光補償原理,顏色補償：采用合適的方法校正熒光染料之間疊加所造成的誤差。在完成雙色以上熒光標記的樣本時，都需要作顏色補償。帶通濾片接受的是一定帶寬波長的熒光，故會有干擾光同時被接收，然后一同進入PMT進行光電轉換并放大。通常干擾光占該染料所發(fā)出熒光總量的X%,補償模型圖,鞘流系統(tǒng)

10、 流動室,鞘液,,鞘流原理 鞘流公式,Re= dρv／η Re為雷諾（Reynolds）系數(shù)，d 為管道直徑，v 為液體流速，密度為ρ ，黏滯系數(shù)為η。 當Re<2300時，液體處于穩(wěn)流狀態(tài)， 當Re ﹥2300時，液體處于湍流狀態(tài)。,數(shù)據(jù)處理分析轉換,數(shù)據(jù)存儲: LIST MODE,數(shù)據(jù)顯示: 直方圖 ( Histogram )二維點圖(

11、Dot Plot)等高線圖(Contour Plot)密度圖 (Density)三維圖（3D Plot）等,外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖（紅細胞溶解后）,熒光信號,雙色直接染色,數(shù)據(jù)分析,直方圖分析,數(shù)據(jù)分析,點圖分析,數(shù)據(jù)分析,等高圖和密度圖分析,數(shù)據(jù)分析,三維圖分析,當前生產(chǎn)流式細胞儀的公司,BD公司貝克曼-庫爾特公司Cytomation公司Bio-Rad 公司Partec公司（德國）Applied Bios

12、ystems公司,BD公司簡介,BD公司是由Maxwell W. Becton和Fairleigh S. Dickinson 于1897年在紐約創(chuàng)立的,總部位于美國新澤西州,BD公司流式細胞儀產(chǎn)品,FACSCount流式細胞儀,FACSCalibur流式細胞儀,FACSCanto流式細胞儀,BD公司流式細胞儀產(chǎn)品,FACS Vantage SE-大型分選機,FACS Aria-高速分選的臺式機,FACS Diva 高速分選的數(shù)字化大型機

13、,貝克曼-庫爾特公司流式細胞儀產(chǎn)品,FC 500 全自動分析儀,,,,Gallios 雙激光6色,EPICS ALTRA分析分選系統(tǒng),AppliedBiosystems公司,AttuneTM 聲波聚焦細胞分析儀,流式細胞儀的應用,細胞內和細胞外發(fā)生了什么事件？,流式細胞儀的應用領域,臨床研究:血液、腫瘤、藥理、免疫….生物學研究：遺傳、生殖、微生物、細胞生物、毒理、分子生物、….環(huán)境研究：海洋生態(tài)研究….制藥工業(yè)食品工業(yè)

14、農(nóng)業(yè)畜牧業(yè),流式細胞儀的臨床應用,HIV免疫分型，CD4絕對計數(shù)白血病和淋巴瘤的免疫分型腫瘤的細胞周期和倍體分析細胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測干細胞計數(shù)殘量白血病細胞檢查HLA-B27檢查血小板功能及相關疾病,流式細胞儀的臨床免疫學應用,淋巴細胞免疫分型淋巴細胞亞群分析CD4絕對計數(shù)HIV與SARS的診斷與研究淋巴細胞CD4/CD8分析CD4絕對計數(shù)T細胞活化,細胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測免疫功能和免疫

15、調控的研究淋巴細胞和單核細胞的活化細胞因子的研究淋巴細胞的增殖樹突狀細胞的研究HLA-B27檢測,淋巴細胞亞群分析,淋巴細胞亞群分析,使用經(jīng)熒光素標記的特異單克隆抗體，進行多色染色，同時對淋巴細胞膜上多種白細胞分化抗原（CD分子）的表達進行分析，可以將淋巴細胞亞群區(qū)分開，并定性分析；淋巴細胞亞群的百分含量淋巴細胞亞群的絕對計數(shù)，進行定量分析,臨床意義,了解在不同情況下體內免疫功能狀態(tài)輔助臨床疾病的診斷探索疾病的發(fā)病機理

16、、病程、預后監(jiān)測、指導臨床治療方案免疫系統(tǒng)疾病免疫缺陷病，AIDS移植病人排斥反應或移植物抗宿主反應的檢測腫瘤病人化療后免疫力檢測,淋巴細胞亞群分析,根據(jù)功能，淋巴細胞主要分為B淋巴細胞（CD19+），與體液免疫有關T淋巴細胞（CD3+），與細胞免疫有關總T和總B可以用來判斷某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NK細胞（CD3-CD16+56+），行使免疫監(jiān)控功能，  能夠介導對某些腫瘤細胞和病毒感染細胞的細胞毒性

17、作用。,淋巴細胞亞群分析,根據(jù)CD4、CD8表達，T淋巴細胞又分為T輔助/誘導細胞（CD3+CD4+）T抑制/細胞毒性細胞（CD3+CD8+）Th/Ts 評價那些自身免疫失調或被懷疑是免疫失調或已知患有免疫缺陷的病人的免疫狀態(tài)，此外，這一比值還可用來監(jiān)測骨髓移植病人以免受到急性GVHD的攻擊 Th/Ts升高：自身免疫性疾病（類風濕性關節(jié)炎、SLE） Th/Ts降低：病毒感染、惡性腫瘤、再生障礙性貧血,常見疾病的T 淋巴細

18、胞的變化：,疾病 CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ 類風濕性關節(jié)炎 ? （活動期） ? ? 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 - 或? （活動期） ? ? ? 多發(fā)性硬化癥

19、 ? 重癥肌無力 ? ? 膜型腎小球腎炎 ? ? 胰島素依賴性糖尿病

20、 ? ? 乙型肝炎 ?自身溶血性貧血 ? ? 上呼吸道感染 ?

21、 ? ?,常見疾病的T 淋巴細胞的變化,CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ 腫瘤 ? ? ? ? ? ? ? ? 再障及粒細胞減少癥 ?

22、 ? ?巨細胞病毒感染 ? ? ? 血小板減少 ? ? ? ? ? ? 活動性特應性皮炎 ? ? ?

23、 ?過敏性皮炎 ? ? ?,淋巴細胞亞群雙色分析,,,,,,,12%,76%,49%,26%,11%,AIDS 病人T亞群分析,27-51%,15-44%,,,,50-84%,先天性無 r 球蛋白血癥,5-18%,,乳腺癌患者T淋巴細胞亞群變化,TriTEST/MultiTest與T淋巴細胞絕對計數(shù),使用三色試劑或四色免

24、洗試劑樣本使用EDTA抗凝全血，用血量50uL免洗操作，減少細胞丟失絕對計數(shù)TruCOUNT管預先加有已知數(shù)量微球，在流式細胞儀上直接得到T淋巴細胞亞群的絕對含量，提高工作效率和計數(shù)的精確度——單平臺計數(shù)MultiSET全自動淋巴細胞亞群軟件進行樣本獲取和分析MultiSET軟件自動做質量檢查，幫助發(fā)現(xiàn)樣本運輸、處理等過程中造成的錯誤醫(yī)生報告T淋巴細胞及TH、TS百分含量、絕對含量和H/S比值，并報告參考值范圍,TriTES

25、T CD4/CD8/CD3分析與T淋巴細胞絕對計數(shù),%T LymphCD3+ Abs CntCD3+CD4+ %T LymphCD3+CD4+ Abs CntCD3+CD8+ %T LymphCD3+CD8+ Abs CntT H/S Ratio,MultiTEST CD3/CD8/CD45/CD4,MultiTEST CD3/CD15+56/CD45/CD19,HLA-B27分析,HLA-B27,? HLA-B

26、27是MHC I類抗原，在有核細胞上廣泛表達? HLA-B27的表達與強直性脊柱炎高度相關，在其它血清陰性骨關節(jié)病、銀屑病性關節(jié)炎、葡萄膜炎等也有明顯表達? 使用流式細胞儀，可以快速、靈敏、準確地分析HLA-B27? BD HLA-B27 Kit檢測HLA-B27，報告檢測的平均熒光強度，根據(jù)界值判定，得到陰性/陽性結果。實驗的靈敏度為100%，特異性為97.5%,HLA-B27,HLA-B27陰性樣本,HLA-B27陽性樣本,,

27、,流式細胞術在臨床血液學中的應用,流式細胞儀的臨床血液學應用,白血病和淋巴瘤免疫分型殘留白血病造血干細胞計數(shù)網(wǎng)織紅細胞的分析陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿（PNH）診斷血小板分析血小板膜糖蛋白分子的表達血小板活化網(wǎng)織血小板分析血小板自身抗體檢測網(wǎng)織血小板計數(shù),白血病免疫分型,FAB分型：AL分為AML（M0-M7）& ALL白血病的MICM分型 Morphology Immunology Cytogen

28、etics Moleculor Genetics 白血病分型是選擇化療方案和判斷預后的重要依據(jù)。白血病免疫分型是MICM分型的重要組成部分，也是對FAB分型的補充，對白血病的診斷、治療策略制定、預后判斷及對白血病發(fā)病機制的研究都具有重要作用。,白血病細胞特性：,白血病細胞的異常表現(xiàn)在抗原系列異常和時間異常 異常的抗原表達(Aberration Antigen Expression) 喪失系

29、列規(guī)律性（lineage infidelity) 過高，過低，不表達， 交叉 喪失分化發(fā)育的階段性（differentiation asynchrony) 早期與晚期抗原同表達,白血病免疫分型抗原,常用白血病細胞系列與分化階段抗原,白血病細胞系列非特異性抗原：干/祖細胞：CD34+、HLA-DR+、CD38-原始細胞：CD34+、HLA-DR

30、+、CD38+幼稚細胞：CD34-、HLA-DR-、CD38+）,白細胞共同抗原：CD45,CD45-SSC的臨床應用,CD45是白細胞的共同抗原成分。所有人類白細胞均表達CD45，包括淋巴細胞、單核細胞、多形核細胞、嗜酸、嗜堿性細胞、胸腺細胞、脾細胞、扁桃腺細胞以及骨髓前體細胞。造血系統(tǒng)細胞CD45表達量與細胞分化程度的高低緊密相關，即分化程度高的細胞CD45表達量高，分化程度低的細胞CD45表達量低（淋巴細胞>單核細胞>

31、;成熟粒細胞>原幼細胞，在紅細胞中不表達；SSC是側向角參數(shù)，反應細胞的顆粒度（成熟粒細胞>單核細胞>原幼細胞>淋巴細胞）。目前，國際上采用CD45—SSC設門（Gating），可非常輕松地將白血病細胞與正常細胞分開，增加白血病免疫分型的準確性。,CD45的臨床應用,用CD45-SSC設門尋找異常細胞，將細胞分為5個群體，當幼稚細胞達70-80%時，即可大致估計AL的類型。骨髓成分復雜，各種大小和分化程度的細胞均

32、有，若不用CD45-SSC設門，我們檢測到的陽性細胞的百分率是以總細胞為分母來計算，當時以陽性細胞大于20%為界線，現(xiàn)在以CD45-SSC設門，排除了正常細胞的干擾，陽性細胞的百分率是以幼稚細胞為分母，因此再以陽性細胞>20%作界線則不太合適了，所以，用CD45-SSC設門尋找異常細胞時，以定性比定量更重要。,正常人血液白細胞免疫表型散點圖,,,正常人血液細胞免疫表型,T淋巴細胞：CD45++++、CD3+/CD4+、CD3+/C

33、D8+、CD5+/CD7+，部分細胞CD（16+56）+，無CD4+CD8+雙陽性細胞B淋巴細胞：CD45++++、CD10-/CD19+、CD20+/CD22+、HLA-DR+/CD13-NK細胞：CD45++++ 、CD（16+56）+/CD3-單核細胞：CD45+++、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+中性粒細胞：CD45++、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比CD33表達更高

34、嗜酸性粒細胞：CD45+++、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比CD33表達更高,,,正常人骨髓有核細胞免疫表型散點圖,正常人骨髓細胞免疫表型,淋巴細胞:CD45++++、CD34-/CD38+、CD5+/CD7+（T淋巴細胞）；CD10-/CD19＋（B淋巴細胞）單核細胞:CD45+++,CD34-/CD38+、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+、CD36+/GlyA-粒系細胞:原粒細

35、胞CD45+、CD34+/CD38+、CD14-/CD33+、HLA-DR+/CD13+早幼粒細胞及其以下各階段中性粒細胞：CD45++、CD34-/CD38+、CD14-/CD33+、HLA-DR-/CD13+，與原粒細胞或更幼稚細胞的表型有明顯差異巨核細胞：CD45++、CD41+/CD61+幼紅細胞：CD45-、CD36+/GlyA+,AML免疫表型,急性T淋巴細胞白血?。═-ALL）骨髓細胞免疫分型散點圖,,,,,,,,

36、急性早幼粒細胞白血?。ˋML-M3）骨髓細胞免疫分型散點圖,,,,,FCM在臨床白血病分型中的作用,▲能正確區(qū)別AML和ALL，并能進一步區(qū)別ALL中的T系和B系及亞型▲能正確鑒別AML中難于鑒別的M0、M6、M7▲診斷雙系或雙表型白血病▲發(fā)現(xiàn)僅表達個別次要非本系列相關抗原的白血病▲診斷少見疑難白血病（如HCL）,免疫分型 對下列情況具有重要意義,用形態(tài)學、細胞化學染色不能肯定細胞來源的白血病。形態(tài)學為急性淋巴細胞白血?。ˋL

37、L）或急性未分化白血?。ˋUL）但缺乏特異性淋巴細胞系列抗原標記?；旌闲园籽?。部分髓系白血病。目前，免疫分型對粒-單核細胞和單核細胞白血病的鑒別尚有一定困難。慢性淋巴細胞白血病。微小殘留白血病。,陣發(fā)性血紅蛋白尿(PNH),陣發(fā)性血紅蛋白尿是由于紅細胞膜的獲得性缺陷，對激活補體異常敏感的一種慢性血管內溶血患者體內紅細胞呈不均一性利用流式細胞術和CD55和CD59單克隆抗體，對PNH患者紅細胞、粒細胞和血小板進行分析，證實存

38、在膜蛋白表達缺陷的血細胞，并計算缺陷細胞在全血中所占比例,陣發(fā)性血紅蛋白尿PNH,正常人紅細胞、粒細胞和血小板CD59表達完全陽性PNH患者血細胞分為三型：Ⅰ型：CD59表達完全陽性，熒光強度與正常人陽性峰熒光強度接近Ⅱ型：CD59表達部分陽性，熒光強度介于Ⅰ型與Ⅲ型之間 Ⅲ型：CD59表達完全陰性分析PNH患者各型細胞所占百分比，評估疾病的嚴重程度,紅細胞 —PNH分析,A 正常人B –D 病人,造血干細胞計數(shù),?造

39、血干細胞是一群有一定增生能力，可以多向分化的造血細胞。?造血干細胞的特征是：?大?。‵SC）和顆粒度（SSC）介于成熟淋巴細胞、大淋巴細胞相似?細胞內含有較多核酸物質? CD34表達弱陽性或強陽性? CD45表達弱陽性?在干細胞移植時需要做造血干細胞絕對計數(shù),造血干細胞計數(shù),血小板檢測,血小板膜糖蛋白復合物診斷血小板缺陷性疾病CD41-CD61復合物：血小板無力癥CD42a-CD42b 復合物：巨大血小板癥血小

40、板活化的相關檢查血小板顆粒膜糖蛋白，如CD62，CD63血小板膜糖蛋白活化表位，如PAC-1血小板減少性疾病血小板自身抗體檢測網(wǎng)織血小板的檢測血小板脫落微粒的檢測,血小板活化,IIb/IIIa復合物（CD41/CD61）在所有靜止和活化的血小板上都有表達血小板活化時發(fā)生的改變IIb/IIIa復合物發(fā)生變構，表達PAC-1血小板內顆粒釋放，分泌促進凝血反應的物質，這時表達CD62P,CD61圈血小板門P

41、AC-1/?1：陰性對照，靜止的血小板PAC-1/CD62P：試驗管，ADP刺激下活化的血小板，報告血小板活化百分含量,血小板活化,,,腦栓塞病人血小板活化檢測,A CD61-SSC設分析門B 陰性對照C 治療前 PAC-I 27.74%CD62P 15.86%D 溶栓后 PAC-I 9.13%CD62P 4.12%,,血小板活化的意義,直接測量循環(huán)血小板活化狀態(tài)與反應性可直接測定凝血酶等誘導劑活化的血小板血小

42、板活化與臨床的關系：監(jiān)測血小板活化相關疾病過程，抗血小板藥物療效或治療藥物的影響，預測血栓形成心肌缺血（心絞痛、心肌梗塞）與血小板活化有關預測冠狀動脈成形術后發(fā)生急性缺血事件的危險性缺血性腦血管病與血小板活化有關子癇前期、外周血管疾病等均有血小板活力增加抗血小板治療療效監(jiān)測,血小板無力癥（CD41缺陷，PAC-I下調）,藍—陰性對照綠—病人紅—正常人,巨血小板癥,藍—陰性對照綠—正常人紅—病人CD41表達上調CD4

43、2a/CD42b缺失,血小板自身抗體 — ITP病人,流式細胞儀的科研應用,免疫功能研究樹突細胞研究干細胞研究癌癥病人的多藥耐藥性細胞動力學功能研究血小板分析（心血管疾病）環(huán)境微生物分析分子生物學研究,Cytometric Beads Array CBA系統(tǒng),簡介,CBA：流式微球陣列又稱液相多重蛋白定量技術，是指用一系列熒光強度不同的微球，將可溶性微粒進行捕獲并檢測的流式技術。每個CBA微球在FL3有特

44、定的熒光強度，大小一致，包被有適用于特定分析（如其他抗體或可溶性蛋白）的特異性抗體，提供了類似ELISAs孔板的捕獲表面。簡而言之，將包被有不同抗體的微球混合在一個樣本中即可進行多參數(shù)檢測。這種技術可大大節(jié)約樣本用量，避免ELISAs分析時對樣本過度稀釋導致分析靈敏度的降低。,CBA原理,操作步驟,檢測物與捕獲微球共孵育;洗滌;標記熒光探測試劑（FITC或PE標記）;洗滌;流式細胞儀檢測;CBA分析軟件批量數(shù)據(jù)分析。,CBA分

45、析軟件,,,CBA技術,,能夠同時對單個樣本進行多種檢測。較傳統(tǒng)檢測大大節(jié)省樣本量。與ELISAs相比靈敏度高、重復性好。所有分析只需一組標準曲線。避免酶聯(lián)反應所致人工假象。節(jié)省操作時間。節(jié)省檢測時間。,與傳統(tǒng)的ELISAs檢測相比,細胞凋亡,細胞膜分析-PS外翻（建議用于懸浮細胞） PS（磷脂酰絲氨酸）正常暴露在胞膜的內表面，凋亡時，PS外翻向細胞外表面。重組蛋白Annexin-V可與PS結合,Annexin V A