主要禽病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法及結(jié)果分析

1、主要禽病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法及結(jié)果分析,張國中（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)）2011年4月23日,2,（一）血清學(xué)檢測(cè)方法 1、免疫血清學(xué)技術(shù)抗原與抗體在體內(nèi)（外）均可發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，因?yàn)榭贵w主要來自于血清，在體外進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)稱為血清學(xué)反應(yīng)或免疫血清學(xué)技術(shù)。,一、常用的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法,,3,血清學(xué)反應(yīng)的一般特點(diǎn)高度特異性反應(yīng)可逆性反應(yīng)二階段性影響反應(yīng)的因素,4,血清學(xué)反應(yīng)的應(yīng)用抗原抗體的快速檢測(cè)微生物的鑒定與分析生

2、物活性物質(zhì)的超微定量抗原抗體在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平定位,,,5,2、血清學(xué)反應(yīng)類型及常用試驗(yàn)方法,6,（1）平板凝集試驗(yàn)（SPA）基本原理：細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒狀抗原與相應(yīng)抗血清在電解質(zhì)存在情況下，產(chǎn)生可見的顆粒凝集現(xiàn)象。主要應(yīng)用：雞白痢（SP） 支原體（MG/MS）,圖1 平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果,8,（2）血凝（HA）和血凝抑制試驗(yàn)（HI）基本原理：某些病毒（如NDV）能夠凝集特定種類動(dòng)物

3、的紅細(xì)胞，此即紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。這種紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象可以被特異性抗血清所抑制，即紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)。主要應(yīng)用：新城疫（ND） 禽流感（AI） 產(chǎn)蛋下降綜合癥（EDS） 雞傳染性支氣管炎（IB）,圖2 血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果,G. Cattoli （OIE）,10,（3）瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）基本原理

4、：可溶性抗原（毒素、病毒、細(xì)菌裂解液）與相應(yīng)抗體結(jié)合, 在電解質(zhì)存在情況下，產(chǎn)生可見的沉淀物。主要應(yīng)用：雞馬立克氏病病毒（MDV）

5、 雞痘病毒（FPV）,圖3 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果1. 抗原；2. 陽性對(duì)照；3-6. 待檢血清；7. 陰性對(duì)照,12,（4）病毒中和試驗(yàn)（VN）基本原理：抗原與相應(yīng)的抗血清按適當(dāng)比例混合作用后，可被中和而失去感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、組織細(xì)胞或雞胚的能力。主要應(yīng)用：雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）的血

6、清分型。,圖4 采用雞胚接種進(jìn)行IBV分離,空白對(duì)照,病毒接種,,,圖5 采用中和試驗(yàn)對(duì)疑似IBV分離物進(jìn)行鑒定與分型,空白對(duì)照,病毒接種,病毒+抗血清,,,,15,（5）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）基本原理：抗原抗體反應(yīng)的特異性 酶促反應(yīng)的高效性使抗原（或抗體）結(jié)合到某種固相載體表面并保持其免疫活性；使抗原（或抗體）與某種酶連接成酶標(biāo)物，這種酶標(biāo)抗原（或抗體）既保留其免疫活性，又保

7、留酶的活性。,16,主要應(yīng)用：多種禽病檢測(cè)抗體檢測(cè)最常用ELISA方法：間接法，是利用酶標(biāo)記的抗抗體（一般為抗雞IgG）檢測(cè)已與固相抗原結(jié)合的抗體。,圖6 間接ELISA方法測(cè)抗體的基本原理示意圖,18,考慮血清學(xué)檢測(cè)的目的血清樣品的采集方法采集血清樣品的數(shù)量血清樣品的標(biāo)記血清樣品的貯藏及運(yùn)輸,3、血清學(xué)檢測(cè)應(yīng)注意的問題,19,1、病原分離鑒定 （1）定義：指通過人工培養(yǎng)的方法分離出病原體的過程。,（二）病原學(xué)檢測(cè)方法,2

8、0,（2）病原分離主要目的進(jìn)行疾病診斷疾病確診的黃金方法病原學(xué)研究的基礎(chǔ),21,（3）病原分離方法細(xì)菌分離培養(yǎng)：各種培養(yǎng)基病毒分離鑒定：雞胚、細(xì)胞或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物接種,22,（4）進(jìn)行病毒分離應(yīng)注意的問題樣品采集時(shí)間采集樣品種類樣品貯藏及運(yùn)輸常見接種途徑常用鑒定方法,23,2、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）（1）主要目的：通過對(duì)特異性基因片段的檢測(cè)達(dá)到檢測(cè)病原體的目的。（2）優(yōu)缺點(diǎn)：方便快捷、存在假陽（陰）性,圖7 常規(guī)RT

9、-PCR檢測(cè)結(jié)果（電泳圖）,25,3、其它病原學(xué)檢測(cè)方法（1）血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)（2）瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）（3）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）（4）膠體金試紙條檢測(cè)（5）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢查,26,1、雛雞母源抗體檢查（1-3日齡） （1）了解原產(chǎn)地的免疫種類了解原產(chǎn)地易發(fā)病種類及保護(hù)性水平確定需根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r加免的疫苗根據(jù)抗體反應(yīng)追蹤是否有過感染,二、實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)方案的制定,27,（2）了解母源抗體水平

10、根據(jù)母源抗體水平及各種疫病母源抗體半衰期合理確定疫苗首免時(shí)間了解雛雞免疫保護(hù)能力，便于疫病診斷,28,2、免疫檢查 （1）免疫前檢查目的是了解免前抗體水平、決定免疫時(shí)間和進(jìn)行免疫效果評(píng)價(jià)。 初免前檢查 再免前檢查,29,（2）免疫后檢查目的是檢查免疫效果，評(píng)價(jià)免疫成功或失敗，盡快采取相應(yīng)措施確保生產(chǎn)安全。通常應(yīng)選擇免疫后14-21天進(jìn)行。,30,（3）定期檢查目的是規(guī)律性檢查抗體消長水平以便及時(shí)采取補(bǔ)救措施，分析各種免疫

11、之間的相關(guān)性，調(diào)整免疫程序。,31,（4）重要節(jié)點(diǎn)檢查30~50d檢查（檢查前幾次免疫效果）開產(chǎn)前檢查（產(chǎn)蛋期及雛雞保護(hù)性抗體需求）36~40W檢查（確定抗體水平、適時(shí)補(bǔ)免）,32,3、生產(chǎn)發(fā)生變動(dòng)時(shí)的檢查 （1）日常規(guī)律性抗體監(jiān)測(cè)做為發(fā)病時(shí)檢查的參考數(shù)據(jù)做為雞群抵抗力的依據(jù)，指示病因分析方向做為流行病學(xué)分析數(shù)據(jù)，利于發(fā)現(xiàn)病原變異,33,（2）雙份血清檢測(cè)鑒于發(fā)病后抗體常有明顯升高，雙份血清抗體值對(duì)比分析有很好的診斷價(jià)

12、值。,34,（3）抗原檢測(cè)某些情況下，抗原檢測(cè)可以直接證實(shí)感染狀況的存在。,35,（4）未免疫雞群抗體檢測(cè)未免疫雞群某疾病抗體的出現(xiàn)，特別注意雛雞母源抗體消失后抗體的再出現(xiàn)以及隨日齡增加而抗體持續(xù)上升的現(xiàn)象，這對(duì)疾病診斷十分重要。,36,4、重要疫病流行動(dòng)態(tài)分析流行動(dòng)態(tài)分析對(duì)生產(chǎn)企業(yè)來說，開展具有一定的難度，但對(duì)重要疫病，尤其是重點(diǎn)進(jìn)行免疫防控的疫病仍然值得重視，對(duì)長期的流行資料進(jìn)行分析，會(huì)得到極為有益的技術(shù)支持。,37,流行動(dòng)態(tài)

13、分析需要進(jìn)行大量工作，除抗體監(jiān)測(cè)外，必需配合針對(duì)性的實(shí)驗(yàn)室研究工作，如病原分離鑒定、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和必要的分子生物學(xué)研究。,38,1、HI檢測(cè)結(jié)果與分析 （1）常見HI檢測(cè)結(jié)果,三、重要疫病的常見檢查結(jié)果與分析,圖8 種雞開產(chǎn)前NDV抗體檢測(cè)情況,40,（2）免疫抗體空檔期15-25d是母源抗體逐漸消失，新的免疫抗體尚未建立的時(shí)期野毒侵襲大多發(fā)生于此，一般18-25d多發(fā)空檔期隨免疫（程序和疫苗）成功達(dá)到最短,圖9 NDV母源抗體衰

14、減情況,圖10 15-30日齡雛雞NDV抗體檢測(cè)情況,43,（3）HI檢查的抗體離散度在4lg2內(nèi)是允許范圍大于4lg2的基本原因初免時(shí)母源抗體水平參差不齊免疫成功率不高-漏免太多疫苗質(zhì)量不好二免后離散度應(yīng)達(dá)到要求,44,（4）抗體保護(hù)臨界值通過攻毒試驗(yàn)加以驗(yàn)證的結(jié)果AIV要求≥26NDV要求≥28-10臨界值是針對(duì)有效保護(hù)對(duì)等而言，即疫苗和流行毒株有良好的相關(guān)性。當(dāng)流行毒株變異而疫苗株保護(hù)性不足時(shí)，原有臨界值在一

15、定程度上失去意義，需要新確立或提高臨界值水平。,45,（5）診斷試劑問題抗原問題：抗原不純（影響HA的確定）抗原制備毒株和流行毒株存在明顯差異陽性血清問題：陽性血清不純,46,（6）診斷指標(biāo)H5N1雙份血清檢測(cè)：應(yīng)用常規(guī) Re-4、Re-5苗免疫情況下，如果知道發(fā)病前抗體水平，則發(fā)病后10-14d可檢測(cè)出Re-4、Re-5抗體滴度上升22-3。未免相應(yīng)疫苗的情況下，檢測(cè)變異株抗體達(dá)到26-9有診斷價(jià)值。,圖11 某肉種雞群

16、發(fā)生H5感染前后抗體檢測(cè)結(jié)果（38W發(fā)生，2W產(chǎn)蛋率75%→5%，死淘20%）,圖12 某肉種雞群H5感染后變異株抗體檢測(cè)結(jié)果（換羽24W發(fā)生，降蛋10%，累計(jì)死亡率5%）,49,H9N2產(chǎn)蛋雞發(fā)病后10-14天，HI抗體20%以上達(dá)到212以上有診斷價(jià)值。雛雞20-30d HI抗體達(dá)到26-9有診斷價(jià)值。,50,ND產(chǎn)蛋雞發(fā)病后10-14d，HI抗體≥213有診斷價(jià)值。雛雞20-35d HI抗體達(dá)到26-9有診斷價(jià)值。,圖

17、13 某肉種雞群發(fā)生NDV感染后抗體檢測(cè)結(jié)果,52,HI診斷應(yīng)注意的問題HI診斷應(yīng)結(jié)合臨床表現(xiàn)，當(dāng)臨床表現(xiàn)無異常而檢測(cè)結(jié)果異常時(shí)往往是檢測(cè)結(jié)果出了錯(cuò)，應(yīng)提高警惕。,53,2、平板凝集試驗(yàn)（SPA）檢測(cè)結(jié)果與分析 （1）可用于MG、MS、SP檢查 （2）可進(jìn)行血清平板和全血平板，相對(duì)來說血清平板更準(zhǔn)確和易于判斷。,54,（3）SPA準(zhǔn)確率相對(duì)較差，假陽性率高，一般群體檢查超過30%以上陽性才有確實(shí)群體感染的診斷意義。（

18、4）國內(nèi)產(chǎn)品和國外產(chǎn)品特異性上有一定差距。,55,3、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）檢測(cè)結(jié)果與分析 （1）可用于MD、POX和IC （2）對(duì)MD可進(jìn)行抗體、抗原兩種檢測(cè)50d左右，50%以上抗體陽性預(yù)示疫苗反應(yīng)正常用羽髓做瓊擴(kuò)有發(fā)病診斷價(jià)值,56,（3）POX常不用檢測(cè)，通過觀察接種部位反應(yīng)可了解免疫效果，觀察臨床癥狀進(jìn)行疫病診斷。（4）IC的瓊擴(kuò)試劑很少，可從國外進(jìn)口或選用日本北里所的間接血凝試劑。,57,4、ELISA

19、檢測(cè)結(jié)果與分析 （1）目前可應(yīng)用ELISA檢測(cè)的疾病ND、AI MG、MS、SPIB、IBD、REO、AE、 RE、ILT、CIAALV-A/B、ALV-J、ALV-Ag,58,（2）常見ELISA檢測(cè)結(jié)果,59,（3） ELISA試劑盒之間的差異每種試劑盒都有自己的特定的陽性值及敏感范圍。原則上同一疾病不同廠家ELISA試劑盒之間沒有直接可比性，除非做過平行對(duì)比研究。同一病原的抗體檢測(cè)可能針對(duì)的抗原表位不同會(huì)得到不同

20、結(jié)果，要格外慎重。,60,（4）對(duì)REV檢測(cè)結(jié)果的認(rèn)識(shí)REV抗體檢測(cè)結(jié)果應(yīng)該為陰性。20-30d檢出陽性率超過20％則預(yù)示雞群可能存在嚴(yán)重免疫抑制問題。,61,當(dāng)1-15d檢出100％陽性率時(shí)，可能大雞免疫或污染過；檢出少于5％陽性率時(shí)，可能種雞是污染群或假陽性結(jié)果。超過30d以上的檢測(cè)通常都只能做為污染的佐證，但至少20%以上才有生產(chǎn)影響意義。,圖14 某雞場(chǎng)免疫禽痘疫苗后的REV抗體檢測(cè)結(jié)果（2W免疫，8W和11W檢測(cè)）,圖

21、15 某雞痘重組疫苗污染REV的檢測(cè)情況,圖16 污染雞痘疫苗分離REV的遺傳進(jìn)化關(guān)系,65,（5）ALV檢測(cè)利用種蛋進(jìn)行ALV抗原檢測(cè)準(zhǔn)確度較好。肛拭子抗原檢測(cè)假陽性較高，高陽性率有一定意義?？贵w檢測(cè)在不同日齡意義不同，雛雞5%以下，開產(chǎn)前10%以下可能不會(huì)形成生產(chǎn)問題。目前ELISA試劑盒均不能區(qū)分內(nèi)外源病毒。,66,（6）有診斷價(jià)值的數(shù)據(jù)IB、Reo的ELISA抗體>15000預(yù)示存在野毒感染。應(yīng)達(dá)到的指標(biāo)在相應(yīng)

22、日齡檢測(cè)達(dá)不到，指示免疫失敗，應(yīng)追蹤疫苗質(zhì)量和免疫技術(shù)。長期檢測(cè)有助于了解抗體變化規(guī)律，用于指導(dǎo)疫苗選擇和免疫程序的制定。按照常規(guī)做檢測(cè)，有利于發(fā)病診斷和監(jiān)督生產(chǎn)問題的發(fā)現(xiàn)。,圖17 25W肉種雞群IBV的ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果,圖18 抗體異常血清雞胚中和試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果,空白對(duì)照,A2毒+A2血清,A2毒對(duì)照,A2毒+待檢血清,,,,,圖19 某1日齡雛雞群MS抗體檢測(cè)情況,圖20 某50日齡雞群MS抗體檢測(cè)情況,圖21 某35W肉