詳細(xì)介紹抗體的生產(chǎn)制備

1、2016.12.05,抗體的生產(chǎn)制備,2/5/2024,,2,特異性抗體的制備與純化技術(shù),多克隆抗體（抗血清）單克隆抗體（雜交瘤技術(shù)）,單克隆抗體與多克隆抗體,2/5/2024,,3,2/5/2024,,4,抗體發(fā)展史,抗體制備技術(shù)主要經(jīng)歷了三代：第一代抗體是傳統(tǒng)的抗體制備方法即利用抗原免疫動(dòng)物后獲得抗體，稱為多克隆抗體（polyclonal antibody）；第二代抗體是通過雜交瘤技術(shù)制備出針對抗原中某一抗原決定簇的抗體稱為單

2、克隆抗體（monoclonal antibody,McAb）；第三代抗體是利用基因工程技術(shù)制備而來，稱為基因工程抗體（genetic engineering antibody）。,第一節(jié) 多克隆抗體的制備與純化,2/5/2024,,5,克隆（clone）:是指無性繁殖細(xì)胞系，是由單一個(gè)祖先細(xì)胞分裂繁殖而形成的一簇細(xì)胞純系。在這個(gè)家族的所有成員中，如無突變發(fā)生，其基因是完全相同的。多克隆抗體（polyclonal antibody ,

3、 pAb）：用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫細(xì)胞，可刺激多個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生針對多個(gè)抗原表位的不同抗體。多獲得的免疫血清實(shí)際上是含有多種抗體的混合物，即多克隆抗體。單克隆抗體（monoclonal antibody, mAb）:由一個(gè)識(shí)別一種抗原表位的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的同源抗體。高度均一、特異性強(qiáng)、效價(jià)高、少或無交叉反應(yīng)性。,2/5/2024,,6,多克隆抗體（抗血清）的制備流程,2/5/2024,,7,（一）抗原的制備（二）免疫動(dòng)物

4、（三）免疫血清的收集、分離和保存（四）抗體的純化（五）免疫血清的鑒定,（六）免疫失敗的可能原因及應(yīng)采取的措施,2/5/2024,,8,（一）抗原的制備,免疫原（immunogen）指能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞；抗原最重要的性質(zhì)是免疫原性（immunogenicity）免疫原—天然抗原、人工合成抗原； 蛋白質(zhì)、多糖、脂類、核酸抗原；,免疫原的分類：（一）細(xì)胞性抗原制備：

5、 綿羊紅細(xì)胞（SRBC）- 溶血素； 細(xì)菌- 抗菌抗體（動(dòng)物免疫血清）（二）可溶性抗原制備： 指蛋白質(zhì)、多糖和脂類等。,2/5/2024,,9,細(xì)胞性抗原：主要包括人、動(dòng)物的細(xì)胞，還有細(xì)菌、螺旋體及寄生蟲等。如菌體（O）

6、抗原的制備：選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株，接種于斜面或平板培養(yǎng)基表面；置溫箱37℃ 培養(yǎng)24h，用適量的無菌生理鹽水刮下菌苔，移入無菌含有玻璃珠的三角瓶中，充分搖勻菌體；100 ℃ 水浴2～2.5h殺菌并破壞鞭毛抗原。取處理過的菌液，檢測有無活菌的存在，合格后用無菌生理鹽水稀釋成每毫升8億～10億個(gè)細(xì)菌，加入苯酚（石炭酸）至最終濃度為5％，即為O抗原。,1）細(xì)胞性抗原或顆粒性抗原,2）可溶性抗原,2/5/2024,,10,可溶性抗原主要包括蛋白質(zhì)、糖蛋

7、白、脂蛋白、脂多糖、酶、補(bǔ)體、細(xì)菌外毒素、核酸等。它們大多數(shù)來源組織細(xì)胞，成分復(fù)雜。制備這類抗原時(shí)，首先需將組織和細(xì)胞破碎，然后再從組織和細(xì)胞勻漿中提取目的成分，提純后的抗原需鑒定后才能用做免疫原。 （1）組織勻漿的制備：所有的組織必須是新鮮的或低溫保存的。器官或組織獲得后立即去除表面的包膜或結(jié)締組織以及大血管，在4 ℃水浴或冰浴中將洗凈的組織剪成小塊，加入適量生理鹽水，裝入搗碎機(jī)破碎制成組織勻漿。 （2）細(xì)胞破碎：提

8、取細(xì)胞可溶性抗原，需將細(xì)胞破碎，常用方法有冷熱交替法、超聲破碎法，反復(fù)凍融法、自溶法和酶處理法等。,（3）蛋白提純,2/5/2024,,11,① 超速離心法：常用密度梯度介質(zhì)有蔗糖、甘油； ② 選擇性沉淀法（鹽析沉淀法）：其原理是根據(jù)蛋白質(zhì)理化特性的差異，采用各種沉淀劑或改變某些條件促使蛋白質(zhì)抗原成分沉淀，從而達(dá)到純化的目的。如選用33～50％飽和度的硫酸胺收集沉淀物；,2/5/2024,,12,③ 凝膠層析法（分子篩層析）：蛋白質(zhì)

9、分子按大小被分離； ④ 離子交換層析；帶電的生物大分子和離子交換色譜填料上的離子基團(tuán)進(jìn)行交換而被分離純化。以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離； ⑤ 親和層析：利用生物大分子的生物特異性如抗原抗體、激素受體、IgG和葡糖球菌蛋白A（SPA）； ⑥ 制備電泳技術(shù)。,2/5/2024,,13,⑦ 其它,聚丙烯酰胺凝膠膠內(nèi)蛋白 可將抗原所在的電泳條帶（或

10、蛋白點(diǎn)）切下,研磨后直接用以動(dòng)物免疫。 NC膜結(jié)合蛋白 將含目的分子的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至NC膜上，麗春紅顯色至清晰顯示目的條帶，取目的條帶置于加有PBS的1.5ml離心管中，用PBS洗至無色，繼而剪碎、研磨，用于動(dòng)物免疫。,2/5/2024,,14,分離純化方法的比較,（4）純化抗原的鑒定,2/5/2024,,15,含量測定：采用常規(guī)蛋白或糖類濃度測定法，一般采用分光光度計(jì)測量法；相對分子量的鑒定：一

11、般采用SDS-PAGE電泳法；純度鑒定：常用區(qū)帶電泳法鑒定。,3）半抗原,2/5/2024,,16,半抗原物質(zhì)多數(shù)為低分子質(zhì)量的物質(zhì)，如：多糖、多肽、甾體激素、脂肪胺、類脂質(zhì)、核酸、某些藥物及其它化學(xué)藥品；常用載體：蛋白質(zhì)類如：牛血清白蛋白、人血清清蛋白、兔血清清蛋白等。多肽聚合物：如多聚Lys（賴氨酸） 大分子聚合物：如羥甲基纖維素；半抗原－載體連接方法：常用物理法和化學(xué)法。 物理吸附的載體有羥甲

12、基纖維素等，其借助電荷和微孔吸附半抗原； 化學(xué)法則是利用某些功能基團(tuán)把半抗原連接到載體上。,2/5/2024,,17,某些物質(zhì)與抗原一起或先于抗原注入機(jī)體，可增強(qiáng)機(jī)體對該抗原的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型，此類物質(zhì)稱為免疫佐劑(immunoadjuvant)，簡稱佐劑。,四）免疫佐劑,良好的佐劑應(yīng)當(dāng)具備以下條件：增加抗原的表面積，并改變抗原的活性基團(tuán)構(gòu)型，從而增強(qiáng)抗原的免疫原性；佐劑與抗原混合能延長抗原在局部組織的存

13、留時(shí)間，降低抗原的分解速度，使抗原緩慢釋放至淋巴系統(tǒng)中，持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體；佐劑可以直接或間接激活免疫活性細(xì)胞并使之增生，從而增強(qiáng)了體液免疫；具有無毒性或副作用低的特點(diǎn)。,2/5/2024,,18,佐劑一般包括以下幾類：①無機(jī)佐劑：如氫氧化鋁、明釩等②生物性佐劑：如結(jié)核分枝桿菌、卡介苗、小棒狀桿菌、百日咳桿菌、革蘭陰性桿菌內(nèi)毒素、霍亂毒素的B亞單位、胞壁酰二肽和細(xì)胞因子等；③人工合成佐劑： 如雙鏈多聚肌苷酸：胞苷酸

14、（poly I：C）、雙鏈多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）；④油劑：如弗氏完全佐劑、花生油乳劑等；⑤納米佐劑,1、佐劑的種類,2/5/2024,,19,應(yīng)用最多的是弗氏佐劑和細(xì)胞因子佐劑弗氏佐劑： 不完全佐劑:液體石蠟+羊毛脂 完全佐劑:液體石蠟+羊毛脂+卡介苗 弗氏佐劑：抗原=1：1 乳化成“油包水”乳液 （乳化方法主要有研磨法和注射器混合法）。 完全佐劑一般不

15、連續(xù)2次使用細(xì)胞因子佐劑： IL-2 IL-1 IFNr（羊痘病毒γ干擾素受體） CSF（集落刺激因子）等,2/5/2024,,20,①增強(qiáng)抗原免疫原性：使無或微弱免疫原性的物質(zhì)變成持久或強(qiáng)的免疫原；②增強(qiáng)機(jī)體對抗原刺激的反應(yīng)性：提高初次應(yīng)答和再次應(yīng)答所產(chǎn)生的抗體滴度；③改變抗體類型：使產(chǎn)生抗體由IgM型轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG型；④引起或增強(qiáng)遲發(fā)性超敏反應(yīng)。,2、 佐劑的免疫生物學(xué)作用,2/5/2024,,21,佐劑的作用機(jī)

16、制歸納起來主要有如下幾種： ①可增強(qiáng)抗原的表面積和改變抗原活性基團(tuán)構(gòu)型，從而增強(qiáng)抗原的免疫原性。 ②佐劑與抗原混合一起注入機(jī)體，可改變抗原的物理性狀，形成抗原儲(chǔ)存庫，延長抗原在局部組織的滯留時(shí)間，有利于抗原的緩慢釋放。 ③增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬作用（被佐劑吸附的抗原易被吞噬細(xì)胞吞噬），促進(jìn)對抗原的處理，刺激淋巴細(xì)胞增生，從而增強(qiáng)和擴(kuò)大免疫應(yīng)答的效應(yīng)。,3、佐劑的作用機(jī)制,二、動(dòng)物免疫,2/5/2024,,22,選擇動(dòng)物時(shí)應(yīng)

17、考慮以下因素：①抗原來源與動(dòng)物種屬的關(guān)系?？乖膩碓磁c免疫動(dòng)物種屬差異越遠(yuǎn)，其免疫源性越強(qiáng)，免疫效果越好，而同種系或親緣關(guān)系越近，免疫效果越差。②動(dòng)物個(gè)體的選擇。適齡、健康、體重符合要求的正常動(dòng)物（以雄性為佳）；抗體需要量少時(shí)，選用家兔、豚鼠和雞等小動(dòng)物；抗體需要量大時(shí)，可選用綿羊、山羊、馬、驢等大動(dòng)物。,（一）免疫動(dòng)物的選擇,2/5/2024,,23,選定動(dòng)物后，在免疫過程中應(yīng)考慮免疫劑量、免疫途徑、免疫次數(shù)、免疫間隔等因素。1

18、、免疫原的劑量：免疫原的接種劑量按免疫原性的強(qiáng)弱、動(dòng)物的個(gè)體狀態(tài)和免疫時(shí)間來確定。首次免疫時(shí)，劑量不宜過大，以免產(chǎn)生免疫麻痹。,（二）免疫方法,免疫途徑通常有皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、腹腔、淋巴結(jié)等，視不同的免疫方案而異。對于不易獲取的寶貴抗原可采用淋巴結(jié)免疫法。免疫間隔時(shí)間是影響抗體產(chǎn)生的重要因素，其中首次與第二次免疫的間隔時(shí)間尤為重要，一般以10～20天為佳，二次后間隔時(shí)間一般為7～10天，若間隔時(shí)間太長，則刺激減弱，抗體效價(jià)不高。

19、,2、免疫途徑與免疫間隔時(shí)間,2/5/2024,,24,（三）免疫血清的收集,1）采血前測抗體效價(jià) 在第2次加強(qiáng)免疫后2周，從兔耳緣靜脈取2～3ml血，制備血清，檢測抗體效價(jià)。如未達(dá)到預(yù)期效價(jià)，需再進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滿意時(shí)為止。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到預(yù)期水平時(shí)，即可放血制備抗血清。 抗血清的效價(jià)：就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價(jià)測定的方法常用的是放射免疫法，此法對所有的抗體均適用。某些由大分子（如蛋白類）抗原所產(chǎn)生的抗體，可

20、用雙向擴(kuò)散等方法測定。前者測定的效價(jià)極為精確。而后者則粗糙得多。,2/5/2024,,25,放射免疫法： 以不同稀釋度的抗血清與優(yōu)質(zhì)標(biāo)記抗原（放射性核素標(biāo)記）混合，孵育24h后，測定其結(jié)合率（用液體閃爍計(jì)數(shù)儀測定Ag*－Ab或游離Ag*）。通常以結(jié)合率為50%的血清稀度為效價(jià)。如某抗血清的結(jié)合率為50%時(shí)的稀釋度為1：15000，則該血清的效價(jià)就是1：15000?？寡宓男r(jià)，除由抗血清本身的性質(zhì)決定外，還受標(biāo)記抗原的質(zhì)量、孵育時(shí)間，所

21、用稀釋液的成分及其pH等因素的影響，在工作中必須引起注意。,2/5/2024,,26,雙向擴(kuò)散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴(kuò)散，兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。瓊脂板的制備：100ml pH7.1 的磷酸鹽緩沖液加到15g的瓊脂內(nèi)，于水浴中加溫，攪拌，使瓊脂完全溶解，趁熱用紗布過濾，待溶液冷卻到65℃左右時(shí)，加入疊氮鈉（NaN3），使其在溶液中的濃度為0.1%。用移液管把瓊脂放在干凈平皿或玻片上

22、，約3mm厚，待其冷卻，完全凝固后，用打孔器打孔。中央孔內(nèi)加適量抗原（容量為50μl），周圍各孔內(nèi)分別加入50μl 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀釋的抗血清，37℃下孵育24h，觀察有無沉淀線產(chǎn)生，以判斷血清的稀釋度。,2）抗血清的采集,2/5/2024,,27,采集：頸動(dòng)脈放血、心臟采血、靜脈采血分離：室溫自然凝固1～2h，然后放4℃冰箱過夜，待血塊收縮后分離血清，有些血清須經(jīng)56℃30min 使補(bǔ)體滅活。保存：

23、4℃保存—存放3個(gè)月至半年 低溫保存（-70 ℃ ～-20 ℃ ）—2至3年，忌反復(fù)凍融 真空干燥保存—4-5年,注意：保存前需經(jīng)除菌 保存液含防腐劑 避免反復(fù)凍融（分裝）,2/5/2024,,28,（四）、抗體的純化,1、目的：盡量除去抗血清中與目的抗體不相關(guān)的成分2、純化方法1）單價(jià)特異性抗血清的純化 單價(jià)

24、特異性是指抗血清只與其特異性抗原發(fā)生反應(yīng)。 去除雜抗體主要方法：親和層析法（將引起交叉反應(yīng)的共同抗原交聯(lián)到Sepharose 4B柱上，把要處理的抗血清通過親和層析柱，共同抗體吸附在柱上，洗脫液則含有特異性抗體）； 吸附法（指將非特異性抗原液與戊二醛制備成固相吸附劑按1：10直接加到免疫血清中去除雜抗體）,2）特異性IgG類抗體的純化,2/5/2024,,29,硫酸銨鹽析：先用50%飽和度去除白蛋白，再用2次33%飽和度沉淀

25、免疫球蛋白。離子交換層析：常用的離子交換劑有DEAE纖維素和QAE纖維素。以QAE-Sephadex最理想。能吸附血清中多種蛋白質(zhì)，但不能吸附IgG.親和層析法：將純抗原交聯(lián)到Sepharose4B，裝柱后，將抗血清通過親和層析柱，特異性吸附IgG。凝膠過濾法：分子篩層析,2/5/2024,,30,（五）免疫血清的鑒定,1. 效價(jià)的測定：顆粒性抗原可采用凝集試驗(yàn)，可溶性抗原常用雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、ELISA等方法。,2. 特異性的鑒

26、定：抗體特異性鑒定常用雙向免疫擴(kuò)散法、免疫電泳法。3. 純度的鑒定： 抗體純度的鑒定可采用SDS-聚丙酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、雙向擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫電泳等方法。 IgG含有重鏈和輕鏈，純IgG的SDS-PAGE結(jié)果應(yīng)有兩條蛋白電泳帶（分子量約53kD和22kD），若出現(xiàn)多條電泳帶則表明制備的抗體混有雜蛋白，需進(jìn)一步純化。4. 親和力的鑒定：測定抗體親力的方法較多，如平衡透析法、ELI

27、SA或RIA（放射免疫技術(shù)）競爭結(jié)合試驗(yàn)等。,第二節(jié) 單克隆抗體的制備和應(yīng)用,2/5/2024,,31,第二節(jié) 單克隆抗體的制備和應(yīng)用,2/5/2024,,32,單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn),單特異性和均一性,無限供應(yīng),用混合的抗原制備出識(shí)別一個(gè)抗原決定簇的抗體,2/5/2024,,33,雜交細(xì)胞（hybrid cell） 在外界某些條件干預(yù)下（如PEG、電穿孔），當(dāng)兩個(gè)細(xì)胞緊密地接觸的時(shí)候,其細(xì)胞膜可能發(fā)生融合，產(chǎn)

28、生具有原來兩個(gè)細(xì)胞染色體/基因的單個(gè)細(xì)胞，稱為雜交細(xì)胞。,2/5/2024,,34,雜交瘤細(xì)胞（Hybridomas） 若用一種腫瘤細(xì)胞與另一種體細(xì)胞（如淋巴細(xì)胞）融合，所形成的雜交細(xì)胞稱為雜交瘤細(xì)胞，簡稱雜交瘤。其既具有腫瘤細(xì)胞無限增殖的能力，也具有淋巴細(xì)胞的一些特性。 B淋巴細(xì)胞雜交瘤 骨髓瘤細(xì)胞與免疫B細(xì)胞融合所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞。,2/5/2024,,35,雜交瘤細(xì)胞,單克隆抗體的制備,2/5/2024,

29、,36,2/5/2024,,37,抗原制備免疫動(dòng)物骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備細(xì)胞融合 雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng) 雜交瘤細(xì)胞的篩選及克隆化單克隆抗體的鑒定 單克隆抗體的制備,單克隆抗體制備的主要步驟,一、抗 原,2/5/2024,,38,細(xì)胞、細(xì)菌和病毒等，一般具有較強(qiáng)的免疫原性，可不加佐劑。例如，直接腹腔注射1~2×107個(gè)細(xì)胞。,顆粒性抗原：,可溶性抗原的來源主要是天然純化，或者用目的基因在原核或真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)

30、?？扇苄钥乖枧c弗氏完全或不完全佐劑混勻，進(jìn)行免疫。,可溶性抗原：,2/5/2024,,39,B淋巴細(xì)胞在目的抗原刺激下增殖、分化，形成能分泌特異性抗體的B淋巴細(xì)胞，有利于細(xì)胞融合形成分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。多次免疫可通過抗體親和力成熟機(jī)制，使B細(xì)胞分泌高親和力抗體，由此形成的雜交瘤往往可分泌高親和力抗體，有更高的應(yīng)用價(jià)值。,二、免疫動(dòng)物,免疫目的：,2/5/2024,,40,采用與骨髓瘤供體同一品系的動(dòng)物 免疫動(dòng)物品系

31、（脾細(xì)胞供體）和骨髓瘤細(xì)胞在種系發(fā)生上距離越遠(yuǎn)則產(chǎn)生的雜交瘤越不穩(wěn)定，獲得的雜交瘤不能在該品系小鼠體內(nèi)誘生腹水。,動(dòng)物的選擇：,動(dòng)物對抗原刺激易產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng),8 ~ 12周齡雌性小鼠（最常用BALB/c）,2/5/2024,,41,2/5/2024,,42,2/5/2024,,43,三、骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備,骨髓瘤細(xì)胞系的選擇要點(diǎn)：,自身不產(chǎn)生免疫球蛋白的重鏈與輕鏈 所選擇的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)與提供免疫脾細(xì)胞的動(dòng)物 品

32、系相同,對氨基碟呤敏感,與免疫脾細(xì)胞融合后產(chǎn)生穩(wěn)定分泌Ig雜交瘤細(xì)胞,2/5/2024,,44,飼養(yǎng)細(xì)胞的作用：,小鼠腹腔巨噬細(xì)胞小鼠脾細(xì)胞,飼養(yǎng)細(xì)胞（feeder cell）：,增加細(xì)胞密度，滿足新生的雜交瘤細(xì)胞對細(xì)胞密 度的要求 吞噬清除死亡的細(xì)胞 分泌生長刺激因子促進(jìn)雜交瘤細(xì)胞的生長,飼養(yǎng)細(xì)胞的種類和制備方法：,2/5/2024,,45,四、細(xì)胞融合,融合前的準(zhǔn)備工作,準(zhǔn)備HAT、HT培養(yǎng)液、融合劑PEG

33、準(zhǔn)備飼養(yǎng)細(xì)胞準(zhǔn)備骨髓瘤細(xì)胞準(zhǔn)備免疫脾細(xì)胞,2/5/2024,,46,拉頸處死小鼠無菌操作取出脾臟清洗、研磨收集細(xì)胞離心洗滌細(xì)胞計(jì)數(shù),脾細(xì)胞的準(zhǔn)備,,2/5/2024,,47,收集細(xì)胞離心洗滌活細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度,骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備,,細(xì)胞融合,2/5/2024,,48,骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞 按一定比例混合1: 10或1: 5 加入促融劑PEG,,PEG,2/5/2024,,49,在聚乙二醇作用下B淋巴細(xì)胞可與骨

34、髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞,,,2/5/2024,,50,五、雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng),HAT選擇性培養(yǎng)的原理： 細(xì)胞的DNA生物合成有主要途徑和補(bǔ)償途徑。當(dāng)有氨基碟呤存在時(shí)，能夠阻斷DNA合成的主要途徑，需通過補(bǔ)償途徑合成DNA，這時(shí)就需要次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）利用次黃嘌呤合成DNA，或胸腺嘧啶核苷激酶（TK）利用胸腺嘧啶核苷合成DNA。,2/5/2024,,51,2/5/2024,,52,用于雜交瘤融合

35、的骨髓細(xì)胞缺乏HGPRT和TK，在HAT培養(yǎng)液中，未融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏HGPRT和TK ，不能利用補(bǔ)救途徑合成DNA而死亡。 未融合的B淋巴細(xì)胞雖具有HGPRT和TK ，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。 只有骨髓瘤細(xì)胞與免疫B細(xì)胞融合的雜交瘤既有骨髓瘤細(xì)胞無限增殖的能力，又從免疫B細(xì)胞得到HGPRT和TK 的基因產(chǎn)物，因此，能夠克服氨基碟呤的阻斷作用，通過次黃嘌呤的補(bǔ)償途徑合成DNA，而在HAT選擇培養(yǎng)液中

36、生長繁殖。,2/5/2024,,53,,,2/5/2024,,54,融合后3~4天后，可見外形似骨髓瘤細(xì)胞，渾圓透亮的克隆。 融合后第7~9天取培養(yǎng)上清，檢測特異性抗體。,細(xì)胞生長情況,,六、雜交瘤細(xì)胞的篩選及克隆化,2/5/2024,,55,雜交瘤分泌單克隆抗體的檢測方法,免疫酶技術(shù)——間接ELISA 包被抗原、培養(yǎng)上清、酶標(biāo)抗體、加底物顯色 陰性對照：骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清 陽性對照：免疫

37、鼠血清 免疫熒光技術(shù),間接免疫熒光（或酶）測定法：靶細(xì)胞鋪片、 固定細(xì)胞、加待測樣品、加熒光標(biāo)記抗體（或 加酶標(biāo)抗體和顯色底物）、鏡檢 活細(xì)胞免疫熒光技術(shù)：流式細(xì)胞術(shù)分析,2/5/2024,,56,雜交瘤細(xì)胞的克隆化,在HAT培養(yǎng)基中生長的雜交瘤細(xì)胞，只有少數(shù)是分泌預(yù)定特異性單克隆抗體的細(xì)胞，因此，必須進(jìn)行篩選和克隆化?？寺』窗雅囵B(yǎng)孔中的細(xì)胞從單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)繁殖，使之成為單克隆，其分泌的抗體達(dá)到均一性。,

38、克隆化的方法主要有：有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法,2/5/2024,,57,有限稀釋法,2/5/2024,,58,（1）克隆前1天制備飼養(yǎng)細(xì)胞層（同細(xì)胞融合）。（2）將要克隆的雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹干，計(jì)數(shù)。（3）調(diào)整細(xì)胞為3～10個(gè)細(xì)胞/ml。（4）取頭天準(zhǔn)備的飼養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細(xì)胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中 。（5）在第7天換液，以后每2～3天換液1次。（6）8～9天可見 細(xì)胞克隆形成，及

39、時(shí)檢測抗體活性。（7）將陽性孔的細(xì)胞移至24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。（8）每個(gè)克隆應(yīng)盡快凍存。,有限稀釋法克隆,2/5/2024,,59,軟瓊脂培養(yǎng)法以適當(dāng)濃度雜交瘤細(xì)胞加入軟瓊脂培養(yǎng)基中，形成由一個(gè)細(xì)胞增殖而成的細(xì)胞集落。,雜交瘤細(xì)胞的克隆化篩選：,2/5/2024,,60,2/5/2024,,61,免疫球蛋白類別及亞類的鑒定,七、單克隆抗體的鑒定,小鼠免疫脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞，其分泌的特異性McAb的本質(zhì)仍是小鼠

40、的不同類型及其亞類的免疫球蛋白Ig），其中以IgG（IgG1、 IgG2a、IgG2b和IgG3等亞類）最常見，其次為IgM。,2/5/2024,,62,抗體親和力是指抗體與抗原或半抗原結(jié)合的強(qiáng)度，其高低主要是由抗體分子結(jié)合表位部位和抗原決定簇之間的互補(bǔ)程度決定。,特異性 是否與其他抗原有交叉反應(yīng)敏感性 對腹水和培養(yǎng)上清進(jìn)行效價(jià)測定 親和力測定,八、單克隆抗體的制備,2/5/2024,,63,大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩

41、種：（1）體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從上清液中獲取單克隆抗體。（2）體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清。,2/5/2024,,64,將雜交瘤細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶（或灌）中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體。收集培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體，不含無關(guān)Ig，但成本髙。,體外培養(yǎng)法,（1）,2/5/2024,,65,①實(shí)體瘤法：對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞按1～3×107/ml

42、接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml,共2～4點(diǎn)。待腫瘤達(dá)到一定大小后（一般10～20天）則可采血，從血清中獲得單克隆 抗體的含量可達(dá)到1～10mg/ml。但采血量有限。,（2）體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞,②腹水的制備：常規(guī)是先腹腔注射0.5ml Pristane (降植烷)或液體石蠟于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動(dòng)物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻

43、于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)到5～10mg/ml，這是目前最常用的方法，還可將腹水中細(xì)胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水塊、量多。,2/5/2024,,66,取Balb/c小鼠, 首先腹腔注射0.5ml液體石臘或降植烷進(jìn)行預(yù)處理。 1~2周后, 腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗