血紅蛋白的提取和分離優(yōu)質課

1、,,,,,,,血紅蛋白的提取與分離,1.分離生物大分子的基本思路：,選用一定的物理或化學的方法分離具有不同物理或化學性質的生物大分子。,2.蛋白質分離和提取的原理：,根據(jù)蛋白質各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質和多少、溶解度、吸附性質和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同種類的蛋白質。,基礎知識,凝膠色譜法,凝膠電泳法,基礎知識,2.凝膠：,大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）構成的多孔小球體，內部有許多

2、貫穿的通道。,根據(jù)被分離的蛋白質相對分子質量的大小，利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用，來進行分離。,1.概念：,（一） 凝膠色譜法（分配色譜法）,基礎知識,（一） 凝膠色譜法（分配色譜法）,3.凝膠色譜法的原理,①當相對分子量不同的蛋白質通過凝膠時，相對分子量較小的蛋白質容易進入凝膠內部的通道，路程較長，移動速度較慢;②而相對分子量較大的蛋白質無法進入凝膠內部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。相對分子質量不同的蛋白質

3、分子因此得以分離。③依據(jù)的特性是：蛋白質分子量的大小。,4.凝膠色譜法分離蛋白質的原理和具體過程,凝膠色譜法分離蛋白質過程的動畫演示,（二）緩沖溶液,1.概念:,在一定的范圍內，凡是能夠抵制外加少量強酸或強堿的影響使原來溶液PH值基本保持不變的混合溶液。,能夠抵制外界的酸和堿對溶液PH值的影響，維持PH基本不變。,2.作用:,基礎知識,（二）緩沖溶液,基礎知識,3.緩沖溶液的配制:,通常由1－2 種緩沖劑溶解于水中配制而成。調節(jié)緩沖劑的

4、使用比例就可以制得在不同PH范圍內使用的緩沖液。,4.提問：在本課題中使用的緩沖液是:____ ,其目的是:,利用緩沖液模擬細胞內的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結構和功能，便于觀察(紅色)和科學研究(活性),磷酸緩沖液,（三） 電泳：,1.概念：,帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。,2.原理：,①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的PH下，這些基團會帶上正電或負電。②在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其

5、所帶電荷相反的電極移動。③電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。,基礎知識,影響蛋白質分子運動速度的因素,√,√,√,√,√,√,√,3.類型:,瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。,,在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動,瓊脂糖凝膠電泳示意圖,,聚丙烯酰胺凝膠電泳,1、測定蛋白質分子量:常用十二烷基硫酸鈉（SDS）

6、—聚丙烯酰胺凝膠電泳。 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網狀結構的凝膠。,N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺（形成交聯(lián)）,丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反應,蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。,2.原理：,SDS能使蛋白質發(fā)生完全變性。解聚成單條肽鏈，因此測定的結果只是單條肽鏈的分子量。SDS能

7、與各種蛋白質形成蛋白質—SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質分子原有的電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。,3. SDS作用機理:,用SDS測定蛋白質分子量的方法,使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質的分子量時，可選用一組已知分子量的標準蛋白同時進行電泳，根據(jù)已知分子量的標準蛋白的電泳區(qū)帶位置，可以測定未知蛋白質的分子量。市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的標準蛋白試劑出售

8、。,電泳檢測結果,,,,實驗操作,樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定,1.樣品處理：,（一）蛋白質提取和分離步驟,（二）操作過程,可選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液來分離血紅蛋白。,2.提問：血液有哪些成分？,1.提問：用雞的紅細胞提取DNA，用豬、牛、羊的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？,雞的紅細胞具有細胞核，含有DNA，便于進行DNA的提??；人的紅細胞無細胞核，結構簡單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。,每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅

9、素基團，此基團可攜帶一分子O2或一分子CO2，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。,血紅蛋白的特點：,(1)紅細胞的洗滌:,去除雜質蛋白，利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化.,1、采集血樣2、低速短時間離心（速度越高和時間越長，會使白細 胞等一同沉淀，達不到分離的效果）3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。4、鹽水洗滌：下層暗紅色的紅細胞+五倍體積的0.9％ 的NaCl溶液洗滌，攪拌10mi

10、n5、低速短時間離心：6、重復3、4、5步驟三次 上清液中已沒有黃色：紅細胞洗滌干凈。,①目的:,②操作：,洗滌次數(shù)過少,無法除去血漿蛋白。,(2)血紅蛋白的釋放：,加蒸餾水到原血液體積，,加40％體積的甲苯 （溶解細胞膜）,置于磁力攪拌器攪拌10min（加速細胞破裂）,紅細胞破裂，釋放出血紅蛋白,,,,(3)分離血紅蛋白溶液：,①過程：將攪拌好混合液轉移到離心管內，以2000r/min的速度離心10 min。,②試管中溶液

11、層次：第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質沉淀層（暗紅色）。,③分離：濾紙過濾：除去脂溶性沉淀層，分液漏斗中靜置：分出下層的紅色透明液體。,甲苯層（無色透明）,白色薄層固體,紅色透明液體,雜質沉淀層（暗紅色）,試管中溶液層次,(4)透 析：,①過程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋

12、放入盛有300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12h,②目的：除去樣品中分子量較小的雜質和離子?；蛴糜诟鼡Q樣品的緩沖液。,透析過程動畫演示,利用透析袋透析,2.凝膠色譜操作:,（1）凝膠色譜柱的制作：,①取長40厘米，內徑1.6厘米的玻璃管，兩端磨平。②底塞的制作： 打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項：玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底

13、面，否則難以鋪實尼龍網，還會導致液體殘留，蛋白質分離不徹底。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應位置組裝成一個整體。⑤安裝其他附屬結構。,,（2）凝膠色譜柱的裝填,①凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度 及分離范圍。 75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨 脹時吸水7.5克

14、。②凝膠的前處理： 配置凝膠懸浮液： 計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中 充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。,2.凝膠色譜操作:,③凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性緩慢倒入色譜柱 內，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻注意：1、裝填時盡量緊密：降低凝膠顆粒之間的空隙。 2、裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗

15、脫次序，降低分離效果。,,④洗滌平衡：連接緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/L的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12h。注意：1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響分離效果2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。,（2）凝膠色譜柱的裝填,50cm高,（3）樣品加入與洗脫,①調節(jié)緩沖液面： 打開下端出口，使緩沖液下降到與凝膠面平齊，關閉出口②滴加透析樣品：吸管吸1ml

16、樣品加到色譜柱的頂端， 注意： 1、不要觸及并破壞凝膠面。 2、貼壁加樣 3、吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣③樣品滲入凝膠床：打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內， 樣品完全進入凝膠層后，關閉下端出口④洗脫：加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當高度， 連接緩沖液洗脫瓶，打開下端

17、出口進行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時，用試管收集流出 液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）,（3）樣品加入與洗脫,注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。,收集得到的純化后的蛋白,思考下面的問題：,讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內，維持結構和功能正常。,,1、在血紅蛋白純化的整個過程中不斷用磷酸緩沖液處

18、理的目的是什么？,2、與其他蛋白質相比，血紅蛋白有什么特點？這一特點對你進行血紅蛋白的分離有什么啟示？,血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。,觀察處理的血液樣品離心后是否分層，如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。 此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細胞，影響后續(xù)血紅

19、蛋白的提取純度。,實驗結果分析與評價,1、你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？,2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？,1、由于凝膠是一種半透明的介質，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。2、加入大分子的有色物質，例如藍色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。3

20、、色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。,血紅蛋白提取和分離的程序包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。樣品的處理：通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、 離心等操作收集到血紅蛋白溶液，樣品的粗分離:透析→去除分子量較小的雜質樣品的純化：凝膠色譜法→除去相對分子質量較大 的雜質蛋白純度鑒定:聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定。,3、你能描述血紅蛋白

21、分離的完整過程嗎？,,④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時。注意：1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內的流動與最終生物大分子物質的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。,（2）凝膠色譜柱的裝填,50cm高,（3）樣品加入與洗脫,①調節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內緩沖液緩慢下降到與凝膠面平

22、齊，關閉出口。 ②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。 ③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內，等樣品完全進入凝膠層后，關閉下端出口。 ④洗脫：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。 ⑤收集：待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml收集

23、一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功） ⑥注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。,（3）樣品加入與洗脫,注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。,觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和

24、時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。,三、實驗結果分析與評價,1、你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？,2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？,由于凝膠是一種半透明的介質，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質，例如藍色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，