動物布病診斷技術(shù)

1、布魯氏菌病檢驗方法：依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)：GB/T18646-2002,適用范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動物布魯氏菌病的診斷技術(shù)。 本規(guī)定的虎紅平板凝集試驗、乳牛全乳環(huán)狀試驗適用于家畜布病田間篩選試驗和乳牛場布病的監(jiān)測及診斷泌乳母牛布病的初篩試驗；試管凝集試驗和補體結(jié)合試驗適用于診斷羊種、牛種和豬種布病感染的家畜。 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的試管凝集試驗不適用于犬種和綿羊副睪種布病感染家畜的檢疫。,虎紅平板凝集試驗,,材料準(zhǔn)備,抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽

2、性血清、陰性血清由指標(biāo)單位提供，按說明用。受檢血清應(yīng)新鮮，無明顯蛋白凝塊，無溶血和無腐敗氣味。準(zhǔn)備一塊潔凈玻璃板，畫成若干個4厘米小格或虎紅平板凝集試驗卡片。吸管或移液器，適于滴加0.03ml（即300μl）液體。牙簽或火柴桿供攪拌用。,操作方法,將玻璃板上各格標(biāo)記受檢血清號(或在布病反映卡上操作)，然后加相應(yīng)血清0.03ml。圖1.在受檢血清旁滴加抗原0.03ml。用牙簽類小棒攪動血清和抗原使之混合。圖2每次試驗應(yīng)設(shè)陰性

3、、陽性血清對照,圖1,圖2,結(jié)果判定,判定結(jié)果前最好將抗原與血清混合物搖動幾下.如圖3.在陰性、陽性血清對照成立的條件下，方可對被檢血清進行判定。被檢血清在4分鐘內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象者判為陽性（+），無凝集現(xiàn)象，呈均勻粉紅色者判為陰性（—）。圖4.圖5每份被檢血清在規(guī)定時間內(nèi)出現(xiàn)凝集反應(yīng)者判為陽性，不出現(xiàn)凝集為陰性反應(yīng)。,圖3,,,陽性,,,陰性,圖 4,陰性,陽性,,,,,圖5,注意事項：,本抗原適合于大數(shù)量田間檢疫和篩

4、選診斷試驗用。本試驗出現(xiàn)陽性反應(yīng)的動物，需經(jīng)補體結(jié)合試驗或其它輔助試驗方可定性。本抗原使用前應(yīng)充分搖勻，方可使用。凡本抗原出現(xiàn)污染或搖不散的凝集塊者不得使用。,,布魯氏菌病乳環(huán)試管凝集試驗,布病全乳環(huán)狀抗原，由指標(biāo)單位提供，按說明用。 乳樣受檢乳樣須為新鮮全乳。采乳樣時應(yīng)將母畜的乳房用溫水洗凈、擦干，然后將乳液擠入潔凈的器皿中。采集的乳樣夏季時應(yīng)于當(dāng)日內(nèi)檢查；保存于2℃時，7d內(nèi)仍可適用。需要器具有：水浴鍋、100μl移

5、液器、1000μl移液器、小試管、試管架、移液器槍頭、乳環(huán)抗原等。,材料準(zhǔn)備：,操作方法,取乳樣1ml，加于滅菌凝集試驗管內(nèi)。取充分震蕩混合均勻的全乳環(huán)狀抗原1滴（約50µl）加入乳樣中充分混勻。置37℃～38℃水浴中60min。加熱后取出試管勿使震蕩，立即進行判定。,結(jié)果判定,強陽性反應(yīng)（+++），乳柱上層乳脂形成明顯紅色環(huán)帶，乳柱白色，臨界分明；陽性反應(yīng)（++），乳脂層的環(huán)帶呈紅色，但不顯著，乳柱略帶顏色；弱陽性

6、反映（+）乳脂層的環(huán)帶顏色較淺，但比乳柱上顏色略深；疑似反映（±）乳脂層的環(huán)帶顏色不明顯，于乳柱分界不清，乳柱不褪色；陰性反映（—）乳柱上層無任何變化，乳柱顏色均勻。,,乳環(huán)試驗陽性,乳環(huán)試驗陽性,,乳環(huán)試驗陰性，乳汁顏色均勻，未見紅色乳環(huán),,布魯氏菌病試管凝集試驗,,材料準(zhǔn)備,稀釋液：0.5%石碳酸生理鹽水。檢驗羊血清時用含0.5%石碳酸的10%鹽溶液，如果血清稀釋用含0.5%石碳酸的10%鹽溶液，抗原的稀釋亦用含0.5

7、%石碳酸的10%鹽溶液。1.2抗原、陽性血清、陰性血清由指標(biāo)單位提供，按說明書使用。1.3 凝集試驗管（三分管）、試管架、吸管及溫箱等。,3分是英制管道直徑長度的叫法，換算成毫米為9.525mm，這里指內(nèi)徑約為10mm試管,操作方法,1.按常規(guī)方法采血分離血清。2.運送和保存血清樣品時防止凍結(jié)和受熱，以免影響凝集價。若3d內(nèi)不能送檢，按每9ml血清加1ml5%石碳酸生理鹽水防腐，也可冷藏方法運送血清。3.被檢血清的稀釋以羊和豬

8、為例，每份血清用4支凝集試管。3.1 第1管標(biāo)記檢驗編碼后加1.15mL稀釋液。3.2 第2～4管各加入0.5mL稀釋液。3.3 然后向第1管內(nèi)加入0.1mL被檢血清，并混合均勻。充分混勻后棄去混合液0.25mL。,,3.4 取0.5ml混合液加入第2管，混合均勻。3.5 再吸第2管混合液0.5mL至第3管，如此倍比稀釋至第4管，從第4管棄去混勻液0.5mL。3.6 稀釋完畢，從第1至第4管的血清稀釋度分別為1:12

9、.5、1:25、1:50和1:100。3.7 牛、馬、鹿、駱駝血清稀釋法與上述基本一致，差異是第1管加1.2mL稀釋液和0.05mL被檢血清。,,3.8 將0.5mL稀釋好（具體稀釋倍數(shù)參照試劑生產(chǎn)廠家的要求，一般是1：10）的抗原加入已稀釋好的各血清管中，并振搖均勻，羊和豬的血清稀釋則依次變?yōu)?:25、1:50、1:100和1:200，牛、馬和駱駝的血清稀釋度則依次變?yōu)?:50、1:100、1:200和1:400。大規(guī)模檢疫時也

10、可只用2個稀釋度，即牛、馬、鹿、駱駝用1：50和1：100，豬、山羊、綿羊和狗用1:25和1:50。,布魯氏菌病試管凝集反應(yīng)試驗（羊、豬）,,吸0.5ml,,,,,布魯氏菌病試管凝集反應(yīng)試驗（牛）,,吸0.5ml,,,,,,3.9 每次試驗均應(yīng)設(shè)陽性血清、陰性血清和抗原對照，a)陰性血清對照：陰性血清的稀釋和加抗原的方法與被檢血清相同。b)陽性血清對照：陽性血清須稀釋到原有滴度，加抗原的方法與被檢血清相同。c)抗原對照：稀釋好的

11、抗原液0.5ml,再加0.5ml稀釋液，觀察抗原是否有自凝現(xiàn)象。 3.10 將稀釋好各管置37℃～40℃溫箱24小時，取出檢查并記錄結(jié)果。,結(jié)果判定,1供判定參照比濁管制備方法略2 結(jié)果判定2.1凝集成度分為：參照比濁管，按各試管上層液體清亮度判讀⑴＋＋＋＋菌體完全凝集，100%下沉，上層液體100%清亮；⑵＋＋＋菌體幾乎完全凝集，上層液體75%清亮；⑶＋＋菌體凝集顯著，液體50%清亮；⑷＋凝集物有沉淀，液體25%清亮

12、；⑸－凝集物無沉淀，液體均勻混濁。,,2.2牛、馬、鹿、駱駝1：100血清稀釋，豬、山羊、綿羊和狗1：50血清稀釋，出現(xiàn)“＋＋”以上凝集現(xiàn)象時，被檢血清判定為陽性。2.3牛、馬、鹿、駱駝1：50血清稀釋，豬、山羊、綿羊、狗1：25血清稀釋，出現(xiàn)“＋＋”以上凝集現(xiàn)象時，被檢血清判定為可疑反應(yīng)?？梢煞磻?yīng)家畜經(jīng)3～4周后重檢，如果仍為可疑，該牛、羊判為陽性。豬和馬經(jīng)重檢仍保持可疑水平，而農(nóng)場的牲畜沒有臨床癥狀和大批陽性患畜出現(xiàn)，該畜被判