鎘對長江華溪蟹心臟組織器官的毒性作用及機制研究.pdf

1、本學(xué)位論文綜合采用光鏡、電鏡、酶學(xué)檢測、流式細胞術(shù)、基因克隆、實時熒光定量PCR等手段與方法，以長江華溪蟹（Sinopotamonyangtsekiense）作為研究對象，采用急性毒性實驗方法，研究了不同濃度鎘暴露對心臟組織器官的影響，旨在闡明鎘對心臟的毒性效應(yīng)和致毒機制。為了研究鎘對心臟組織器官的細胞與生化毒理學(xué)效應(yīng)，就心肌細胞顯微與亞顯微結(jié)構(gòu)進行了觀察，并且檢測了鎘的蓄積、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧

2、化物酶(GPx)三種抗氧化酶的活力和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量，探討了心肌細胞結(jié)構(gòu)改變和氧化應(yīng)激之間的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，為了求證鎘對心臟造成氧化損傷后是否進一步誘導(dǎo)心肌細胞發(fā)生凋亡，分別采用Hoechst33258熒光染色法、瓊脂糖凝膠電泳法、AnnexinⅤ-FITC/PI流式細胞技術(shù)和Caspase-3酶活力測定的方法，檢測了鎘對心肌細胞凋亡的影響。之后，為了探明心臟對鎘的應(yīng)答反應(yīng)，采用RT-PCR技術(shù)克隆得到了長江華溪蟹

3、一種熱休克蛋白70(SyHSP70)基因的部分eDNA序列，并利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了鎘誘導(dǎo)SyHSP70和MT mRNA表達的變化特征。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1、鎘對長江華溪蟹主要組織器官細胞的影響
　　采用石蠟切片和H.E.染色方法，研究了7.25、14.50、29.00、58.00、116.00 mg·L-1鎘暴露4d后，對長江華溪蟹肝胰腺、鰓、心臟和精巢四種主要組織器官組織細胞的影響，旨在為后續(xù)研究工

4、作奠定基礎(chǔ)，為鎘對溪蟹生化、分子水平的影響提供支持和依據(jù)。結(jié)果顯示，四種組織器官均有不同程度的損傷，且隨鎘濃度的增大損傷不斷加重。肝胰腺組織細胞的變化包括:R細胞數(shù)目持續(xù)增加、空泡化，壞死細胞脫落和腺管壞死等。鰓組織細胞:鰓葉間隙紊亂，pillar細胞系統(tǒng)被破壞，腎原細胞和血細胞數(shù)目增加，鰓葉變寬，多處鰓葉上皮斷裂以及有毛細管擴張現(xiàn)象。心臟組織細胞:灶性區(qū)域變性和壞死，并伴隨有炎細胞浸潤現(xiàn)象。精巢組織細胞:生精細胞排列不規(guī)則，空泡樣結(jié)構(gòu)

5、增多，初級精母細胞和次級精母細胞核固縮現(xiàn)象加劇，管腔內(nèi)精細胞減少，生精細胞以及生精小管壞死。實驗結(jié)果提示鎘暴露后溪蟹主要組織器官結(jié)構(gòu)的改變很可能影響了生物體的主要生理功能，例如肝胰腺的吸收、儲存和分泌，鰓的呼吸、滲透和離子調(diào)節(jié)及精子發(fā)生。研究結(jié)果表明組織病理學(xué)的變化能夠靈敏反映鎘對甲克動物的脅迫程度及毒性大小，可作為水生態(tài)環(huán)境鎘污染程度的生物評估指標(biāo)。
　　2、鎘誘導(dǎo)長江華溪蟹心臟組織細胞結(jié)構(gòu)的改變與氧化損傷作用
　　采用急

6、性體外鎘暴露法，研究了7.25、14.50、29.00、58.00、116.00 mg·L-1鎘暴露1d、3d、5d、7d后長江華溪蟹心臟中鎘蓄積情況和顯微結(jié)構(gòu)與亞顯微結(jié)構(gòu)、抗氧化酶活性和脂質(zhì)過氧化的變化。結(jié)果顯示，鎘的積累具有濃度-效應(yīng)關(guān)系，在鎘濃度116.00 mg·L-1暴露5d時積累量達到最大（14.0±1.67μg·g-1），是對照組的13.2倍。光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，鎘暴露時間較短時對心臟組織細胞的影響不明顯。但是隨濃度和時間的增加

7、，出現(xiàn)心肌水腫、空泡變性、玻璃樣變性、炎細胞浸潤等病理現(xiàn)象。透射電鏡觀察顯示，心肌細胞核變形、染色質(zhì)濃縮邊集、核固縮、核碎裂，線粒體空泡化、嵴斷裂、嵴溶解，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹，肌原纖維水腫以及有炎細胞浸潤現(xiàn)象。心臟抗氧化酶活性也發(fā)生了不同程度的改變，SOD活性在整個處理期間顯著增高，CAT和GPx活性分別在暴露5d的14.50 mg·L-1和7.25 mg·L-1濃度組升高，之后活性降低。MDA含量在5d和7d時顯著增加，脂質(zhì)過氧化加劇。結(jié)論:

8、鎘的高濃度及長時間積累對心臟有明顯的毒性作用，其作用機制與氧化脅迫和脂質(zhì)過氧化有關(guān)。
　　3、鎘誘導(dǎo)長江華溪蟹心肌細胞凋亡的研究
　　采用Hoechst33258熒光染色法、瓊脂糖凝膠電泳法、AnnexinⅤ-FITC/PI流式細胞術(shù)、Caspase-3酶活力測定的方法，分別從細胞形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)水平觀察和檢測了急性鎘暴露(7.25、14.50、29.00、58.00、116.00mg·L-1)1 d、3d、5d和7d誘導(dǎo)長

9、江華溪蟹心肌細胞凋亡的情況。結(jié)果顯示，熒光顯微鏡未觀察到典型的凋亡細胞核形態(tài)學(xué)變化;瓊脂糖凝膠電泳圖譜未出現(xiàn)凋亡細胞所特有的梯狀條帶;流式細胞技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)雖然細胞凋亡率增加，但與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;Caspase-3活性也沒有顯著性變化(P＞0.05)。因此，在本實驗所選取的濃度和時間范圍內(nèi)，鎘未誘導(dǎo)長江華溪蟹心肌細胞發(fā)生細胞凋亡，這與本課題組前期研究中觀察到的肝胰腺、精巢組織在染毒2d、7d發(fā)生細胞凋亡的情況明顯不

10、同。原因可能與心臟組織的特殊功能有關(guān)。
　　4、鎘誘導(dǎo)長江華溪蟹心臟熱休克蛋白70和金屬硫蛋白基因表達的研究
　　采用RT-PCR技術(shù)從長江華溪蟹心臟組織中克隆得到一種熱休克蛋白70(SyHSP70)基因的部分cDNA序列，長度為1735bp。將獲得的cDNA序列以及推導(dǎo)的氨基酸序列采用BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性搜索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該cDNA序列和氨基酸序列與甲殼動物的HSP70有極高的同源性，分別高達89％

11、和97％。利用實時熒光定量PCR技術(shù)研究了7.25、14.50、29.00、58.00、116.00 mg·L-1鎘暴露1d、3d、5d、7d對心臟SyHSP70和MT mRNA表達的影響。結(jié)果表明，在鎘濃度58.00 mg·L-1、116.00 mg·L-1處理1d和鎘濃度7.25 mg·L-1、14.50 mg·L-1處理3d時SyHSP70 mRNA的表達量（以β-actin mRNA水平為內(nèi)參）顯著下降，但是，5d和7d的所有濃