液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量【畢業(yè)論文】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí) 農(nóng)業(yè)資源

2、與環(huán)境 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p>　　[摘要] 孔雀石綠是食品安全領(lǐng)域里繼蘇丹紅后在國

3、際上引起轟動(dòng)的又一高危物品，其具有高毒素、高殘留和致癌、致畸、致突變等副作用，不僅對(duì)食用水生動(dòng)物和人類健康造成威脅，而且使我國水產(chǎn)品出口因孔雀石綠殘留問題屢遭貿(mào)易壁壘。本實(shí)驗(yàn)建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠(MG)及其代謝物隱色孔雀石綠(LMG)殘留量的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)方法。該法在GB/T19857-2005檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，采用空白魚肉樣品添加不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收率計(jì)算，結(jié)果采用內(nèi)標(biāo)

4、法定量，以氘代孔雀石綠(MG-D5)和氘代隱色孔雀石綠(LMG-D6)為對(duì)應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)物。結(jié)果表明，該方法用于水產(chǎn)品中孔雀石綠及隱色孔雀石綠的測(cè)定快速，準(zhǔn)確，精密度好，回收率高，能夠很好的滿檢測(cè)要求。且MG和LMG兩種待測(cè)物在1～50.0ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(相關(guān)系數(shù)R2>0.99)，方法檢出限均為0.5μg/kg，在加標(biāo)量為0.5、2.0和10.0μg/kg 水平下，空白魚肉加標(biāo)樣品回收率均大于70%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RS

5、D均小于10%。</p><p>　　[關(guān)鍵詞] 孔雀石綠 水產(chǎn)品 食品安全 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜</p><p>　　Rapid residue determination of malachite green in aquatic products by UPLC-MS/MS</p><p>　　[Abstract] Malachite G

6、reen is another high-risk items in the field of international food safety, which has high toxins, high residue and carcinogenic, teratogenic, mutagenic and other side effects, it’s not only a threat to edible aquatic ani

7、mals or human health, but also it is export trade barriers because of malachite green residues in aquatic products.We developed a rapid and accurate method by UPLC-MS/MS to determine the residue of malachite green(MG) an

8、d their metabolites LMG in aquatic pro</p><p>　　[Keywords] Malachite green aquatic products food safety UPLC-MS/MS </p><p>　　當(dāng)今世界，人類面臨著人口、資源、環(huán)境三大問題，面對(duì)21世紀(jì)誰來養(yǎng)活中國人的問題，我國在大力開發(fā)利用海洋生物資源的同時(shí)，也大力發(fā)

9、展水產(chǎn)養(yǎng)殖，減輕對(duì)海洋水產(chǎn)品資源的過分依賴，同時(shí)也緩解人口增加而帶來的食品、資源等一系列問題。水產(chǎn)養(yǎng)殖是我國國民經(jīng)濟(jì)的重要組成部分，為國民經(jīng)濟(jì)建設(shè)和人民生活水平提高做出了重要貢獻(xiàn)，但隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，食用水產(chǎn)品質(zhì)量等問題迅速暴露出來，水產(chǎn)養(yǎng)殖中存在水體污染與濫用各種漁藥與添加劑等情況，使得環(huán)境保護(hù)與水產(chǎn)品品安全成為困擾人類并亟待解決的問題。近年來,“孔雀石綠”事件的頻繁發(fā)生，日益引起社會(huì)各界的廣泛關(guān)注。水產(chǎn)養(yǎng)殖是我國國民經(jīng)濟(jì)的重要組

10、成部分，但隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，水產(chǎn)養(yǎng)殖中存在水體污染與濫用各種漁藥與添加劑等情況，使水產(chǎn)品質(zhì)量問題日益凸顯，水產(chǎn)品安全成為捆饒人類并亟待解決的問題并引起當(dāng)今社會(huì)各界的廣泛關(guān)注。我國是水產(chǎn)品生產(chǎn)大國，又是水產(chǎn)品的出口大國，藥物殘留已成為水產(chǎn)品出口的主要障礙，尤其是孔雀石綠的殘留，號(hào)稱蘇丹紅第二，在魚體內(nèi)長時(shí)間殘留，且具有高毒性、高殘留和致癌、致畸、致突變等副作用，不僅對(duì)食用水生動(dòng)物和人類健康造成威脅，而且使我國水產(chǎn)品出口因孔雀石綠<

11、;/p><p><b>　　1. 關(guān)于孔雀石綠</b></p><p>　　孔雀石綠是食品安全領(lǐng)域里繼蘇丹紅以后在國際上引起轟動(dòng)的又一高危物品，其具有高毒素、高殘留和致癌、致畸、致突變等副作用?？兹甘G(MG)是一類三苯甲烷類染料,最先應(yīng)用在紡織工藝,后因其具有消毒性和殺菌性而廣泛用于水產(chǎn)品的養(yǎng)殖過程，因其低價(jià)高效,當(dāng)前還找不到特效藥完全取代而在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用?？兹?/p>

12、石綠的分子式：C23H25ClN2，相對(duì)分子質(zhì)量：364．9,其在水生生物體中的主要代謝產(chǎn)物為隱色孔雀石綠，分子式：C23H26N2，相對(duì)分子質(zhì)量：330.48。</p><p>　　l.1 孔雀石綠代謝和殘留</p><p>　　孔雀石綠進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體后，通過生物轉(zhuǎn)化，而轉(zhuǎn)變成脂溶性的隱色孔雀石綠，其在動(dòng)物體內(nèi)代謝很慢，并不斷蓄積，即使在魚卵孵化中使用孔雀石綠防治水霉病，也會(huì)在魚種或咸魚中

13、檢出[2]。孔雀石綠進(jìn)入水生動(dòng)物體內(nèi)，會(huì)快速的代謝成脂溶性的隱色孔雀石綠。0.1mg/L孔雀石綠藥浴歐鰻24h，藥浴6h鰻魚體內(nèi)孔雀石綠殘留達(dá)到峰值，72 h后鰻體內(nèi)孔雀石綠90%被代謝，720h有些魚體內(nèi)檢測(cè)不出孔雀石綠。而隱色孔雀石綠在藥浴72h達(dá)到峰值，然后緩慢代謝，720h只代謝了50%，2400h后魚體肌肉中仍有15±12μg/kg檢出。翟毓秀等[2]報(bào)道，孔雀石綠主要在受精卵和魚苗的血清、肝、腎、肌肉和其他組織中蓄

14、積。通過對(duì)鲇魚的孔雀石綠藥浴實(shí)驗(yàn)證明，在7d內(nèi)，孔雀石綠從687μg/kg消減到17μg/kg，而隱色孔雀石綠則從814μg/kg消減到451μg/kg。邱緒建等[3](2006)，對(duì)鯽魚以200mg/L濃度孔雀石綠進(jìn)行藥浴1h，隱色孔雀石綠殘留從6 h以后，呈非常平緩的下降趨勢(shì)，消除時(shí)間較長，至30d時(shí)仍有17.7/μg/kg 的殘留。對(duì)用濃度為0.8mg/L的孔雀石綠溶液藥浴1h的大菱鲆，孔雀石綠在大菱</p><

15、;p>　　1.2 孔雀石綠毒性和危害</p><p>　　孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物隱色孔雀石綠有較大的毒副作用[27]，會(huì)引起魚類消化道、鰓和皮膚輕度發(fā)炎，妨礙腸道酶分泌。在水體中能夠溶解足夠的鋅，引起水生動(dòng)物鋅中毒。更為嚴(yán)重的是孔雀石綠在魚體內(nèi)殘留時(shí)間長，是一種致癌、致畸、致突變的藥物，對(duì)人類造成潛在危害?？兹甘G及其代謝產(chǎn)物隱色孔雀石綠的毒性是其結(jié)構(gòu)所決定的。因其分子中的與苯基相連的亞甲基和次甲基受苯環(huán)影響

16、有較高的反應(yīng)活性，可生成自由基一三苯甲基等代謝產(chǎn)物衍生物及初級(jí)和次級(jí)的代謝產(chǎn)物，均具有與致癌芳香胺類似的結(jié)構(gòu)，而其進(jìn)人人體后，會(huì)穿透細(xì)胞膜，到達(dá)細(xì)胞核中的DNA，從而產(chǎn)生活潑的親電子“陽氮離子”，攻擊DNA上的親核位置，相互以共價(jià)鍵結(jié)合，破壞DNA引起癌變。</p><p>　　1.2.1 孔雀石綠對(duì)水生動(dòng)物的毒性和危害</p><p>　　水生動(dòng)物對(duì)孔雀石綠均很敏感，其安全質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般在

17、0.1mg/L以下[6]?？兹甘G能引起魚類的鰓和皮膚上皮細(xì)胞輕度炎癥，能使腎管腔有輕度擴(kuò)張，腎小管壁細(xì)胞的胞核擴(kuò)大，影響魚腸中酶的分泌，從而影響魚的攝食及生長?？兹甘G對(duì)水生動(dòng)物的毒性還表現(xiàn)在致癌、致畸、致突變方面。有研究表明，孔雀石綠的濃度增加1倍，其致死率可增加20倍，孔雀石綠是一種劇毒物[7]。孔雀石綠用于虹鱒后可導(dǎo)致基因突變、致癌、染色體破碎、畸形和繁殖能力下降，虹鱒長期使用孔雀石綠后發(fā)現(xiàn)魚卵發(fā)育異常，受精38 h后胚胎成活率

18、顯著下降，孵化時(shí)間延長，脊柱、頭、鰭、和尾發(fā)育異常[4]?？兹甘G能使淡水魚魚卵染色體發(fā)生異常，孔雀石綠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于1mg/mL，仍能使兔和魚繁殖致畸；當(dāng)孔雀石綠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于0.2mg/L時(shí)，對(duì)軟體動(dòng)物東風(fēng)螺的受精卵或是幼體都會(huì)造成不同程度的發(fā)育畸形。周立紅等[7]認(rèn)為，孔雀石綠可使鳙魚和尼羅羅非魚的紅細(xì)胞產(chǎn)生微核，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5mg/L時(shí)，微核率分別達(dá)到0.133%和0.0717%，且微核率隨藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而提高。<

19、/p><p>　　1.2.2 孔雀石綠對(duì)人和哺乳動(dòng)物的毒性</p><p>　　孔雀石綠對(duì)人類和哺乳動(dòng)物具有高毒性和高致癌性[14]。孔雀石綠與隱色孔雀石綠均能使大鼠的肝細(xì)胞空泡化，無色孔雀石綠還能使甲狀腺濾泡上皮大量凋亡，減少公鼠甲狀腺激素的釋放；還能抑制血漿膽堿脂酶產(chǎn)生作用，可能造成乙酰膽堿的蓄積而出現(xiàn)神經(jīng)癥狀[4]。孔雀石綠的化學(xué)官能團(tuán)是三苯甲烷，其分子中與苯基相連的亞甲基和次甲基受苯環(huán)

20、影響有較高的反應(yīng)活性，可生成自由基一三苯甲基， 同時(shí)孔雀石綠也能抑制人類谷胱甘肽—S—轉(zhuǎn)移酶的活性，兩者均能造成人類器官組織氧壓的改變，使細(xì)胞凋亡出現(xiàn)異常，誘發(fā)腫瘤和脂質(zhì)過氧化，而來源于上皮組織的惡性腫瘤即為“癌”[8]。楊先樂等[4]報(bào)道，孔雀石綠能使培養(yǎng)的倉鼠胚胎細(xì)胞產(chǎn)生過多的自由基造成脂質(zhì)過氧化；孔雀石綠能抑制培養(yǎng)的原始鼠肝臟細(xì)胞DNA和EGF的合成，誘使乳酸脫氫酶的釋放，誘使肝臟腫瘤的發(fā)生；孔雀石綠能通過促進(jìn)增殖細(xì)胞核抗原(PC

21、NA)和GUS期細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)而誘發(fā)大鼠肝臟腫瘤。美國國家毒理學(xué)研究中心研究發(fā)現(xiàn)，給予小鼠隱色孔雀石綠728d，其肝臟腫瘤明顯增加。</p><p>　　由于MG具有高毒、高殘留和致癌、致畸、致突變等特點(diǎn)，當(dāng)其進(jìn)入生物體內(nèi)，會(huì)產(chǎn)生具有更強(qiáng)危害的隱色孔雀石綠(LMG)，因此，包括中國在內(nèi)的許多國家都將MG列為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的禁用藥物。然而，由于MG具有價(jià)格低廉、效果顯著等優(yōu)點(diǎn)，其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的使用屢禁不止，這不但對(duì)

22、人體健康造成威脅，而且嚴(yán)重影響了中國水產(chǎn)品的出口；我國也于2002年5月將孔雀石綠列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》中，禁止用于所有食品動(dòng)物。因此，如何快速、準(zhǔn)確地測(cè)定該類禁用藥物，特別是其代謝物在水產(chǎn)品中的殘留量，對(duì)于水產(chǎn)品出口企業(yè)非常重要。</p><p>　　1.3 孔雀石綠的檢測(cè)方法</p><p>　　當(dāng)前國家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)之一的GB/T 19857—2005，要求孔雀石綠在水產(chǎn)

23、品中的檢出率不得超過1μg/kg，比歐盟標(biāo)準(zhǔn)還要嚴(yán)格[10]。國家規(guī)定采用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱色孔雀石綠的殘留量均不得超過0.5μg/kg，而采用高效液相色譜法測(cè)定兩者的殘留量不得超過2μg/kg，比水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中SC/T 3024—2004規(guī)定的用高效液相色譜法測(cè)定孔雀石綠<2μg/kg，隱色孔雀石綠<4μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)還要嚴(yán)格 。</p><p>　　1.3.1 樣品的前處

24、理選擇</p><p>　　樣品采集和前處理是目前環(huán)境分析化學(xué)的瓶頸，它制約著環(huán)境分析化學(xué)的發(fā)展，而且往往是測(cè)定誤差的主要來源。因此，樣品的前處理技術(shù)是目前環(huán)境分析化學(xué)研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)之一?？兹甘G樣品的前處理過程通常采用液液萃取或者固相萃取等。固相萃取是一種基于液相色譜分離機(jī)制的樣品前處理方法。該法利用固體吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，與樣品中的基體和干擾化合物分離，然后用洗脫液洗脫，從而達(dá)到分離與凈化目

25、標(biāo)化合物的目的。其主要分離模式有正相SPE(吸附劑極性大于洗脫液極性)、反相SPE(吸附劑極性小于洗脫液極性)、離子交換SPE和吸附SPE。SPE具有有機(jī)溶劑用量少、便捷、安全、高效等特點(diǎn)，正在不斷地被國內(nèi)外專家進(jìn)行痕量孔雀石綠樣品的預(yù)處理中。</p><p>　　1.3.2 檢測(cè)方法選擇</p><p>　　目前孔雀石綠的檢測(cè)以理化檢測(cè)法和免疫學(xué)檢測(cè)法為主[15]。理化檢測(cè)包括薄層層析法

26、、分光光度法、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(LC)、液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)檢測(cè)法(LC—MS)、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(GC—MS)；免疫學(xué)檢測(cè)主要用酶聯(lián)免疫檢測(cè)法。而高效液相色譜法(HPLC)因具有快速高效、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)國內(nèi)檢測(cè)此類藥物的標(biāo)準(zhǔn)方法有GB/T19857-2005、GB/T20361-2006[18]和SN/T1768-2006等。液相色譜方法存在前處理復(fù)雜、加標(biāo)回收率不高和檢測(cè)限較高等缺點(diǎn)，氣相色譜方法同樣存在著前處

27、理操作步驟多、耗時(shí)較長、費(fèi)用高及檢測(cè)過程使用大量有毒試劑等缺點(diǎn)[28]，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法與其他色譜檢測(cè)技術(shù)相比，具有更高的選擇性和靈敏度，自動(dòng)化強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以很好的降低孔雀石綠及其代謝物作的檢測(cè)限值，且更好滿足為水產(chǎn)品中禁用藥物的檢測(cè)要求，已成為測(cè)定孔雀石綠的首選方法[29]。因此，在GB/T19857-2005檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)水產(chǎn)品中MG及其代謝物L(fēng)MG的殘留量進(jìn)行檢測(cè)，該方法快

28、速、準(zhǔn)確、靈敏度高，完全可以達(dá)到水產(chǎn)品出</p><p>　　2. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法</p><p><b>　　2.1 原理</b></p><p>　　試樣中的殘留物用乙腈提取后，經(jīng)中性氧化鋁固相萃取柱凈化后用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。</p><p>　　2.2 試劑及其配制</p

29、><p>　　(除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純，水為重蒸餾水)</p><p>　　2.2.1 色譜純乙腈。</p><p>　　2.2.2 色譜純甲醇。</p><p>　　2.2.3 無水乙酸銨。</p><p>　　2.2.4 色譜純甲酸。 </p><p>　　2.2.5 5mmol/L

30、乙酸銨緩沖溶液：稱取0.385g無水乙酸銨溶解于1000mL水中，甲酸調(diào)pH到4.5，過0.22μm濾膜。</p><p>　　2.2.6 中性氧化鋁柱：1g/3mL，使用前用5mL乙腈活化。</p><p>　　2.2.7 標(biāo)準(zhǔn)品：孔雀石綠（MG）、隱色孔雀石綠（LMG）、同位素內(nèi)標(biāo)氘代孔雀石綠（MG -D5）、同位素內(nèi)標(biāo)氘代隱色孔雀石綠（LMG-D6），純度大于98%，德國Dr公司生產(chǎn)

31、。</p><p>　　2.2.8 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取適量的孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氘代孔雀石綠、氘代隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈分別配制成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。</p><p>　　2.2.9 標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(1μg/mL)分別準(zhǔn)確吸取1.00mL孔雀石綠、隱色孔雀石綠的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（2.2.8）至100mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，1mL該溶液分別含1μg的孔雀石綠、隱色孔雀

32、石綠，-18℃避光保存。</p><p>　　2.2.10混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液(100ng/mL)：用乙腈稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，配制成每毫升含孔雀石綠、隱色孔雀石綠均為100ng的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，-18℃避光保存。</p><p>　　2.2.11混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液：用乙腈稀釋標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(2.2.8)，配制成每毫升含氘代孔雀石綠和氘代隱色孔雀石綠各100ng的內(nèi)標(biāo)混合溶液，-18℃避光保存。

33、</p><p>　　2.2.12混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)需要，臨用時(shí)吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液(2.2.10)和混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液(2.2.11)，用乙腈-5mmol/L乙酸銨溶液(1+1)稀釋配制適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，每毫升該混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液含有氘代孔雀石綠和氘代隱色孔雀石綠各2ng。</p><p><b>　　2.3儀器和設(shè)備</b></p>

34、<p>　　2.3.1 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電噴霧離子源)，超高效液相色譜為Waters Accurity UPLC，三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜為Waters Premier XE，均為美國沃特世公司生產(chǎn)。</p><p>　　2.3.2 超聲波清洗器SK2510HP，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。</p><p>　　2.3.3 旋渦振蕩器，德國IKA公司。</

35、p><p>　　2.3.4 固相萃取裝置，美國supelco公司。</p><p>　　2.3.5 SL-502N型臺(tái)式天平，上海華巖設(shè)備儀器有限公司。</p><p>　　2.3.6 Centrifuge5810臺(tái)式高速離心機(jī)，德國艾本德公司。</p><p>　　2.3.7 R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海精勝科學(xué)儀器有限公司。</

36、p><p>　　2.3.8 AL204型電子天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司。</p><p>　　2.3.9 IKAT18基本型組織搗碎機(jī)，德國IKA公司。</p><p><b>　　2.4實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p><b>　　2.4.1樣品提取</b></p><

37、;p>　　稱取（5±0.02）g已搗碎樣品于50mL聚丙烯塑料離心管中，加入200μL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.2.11），加入11mL乙腈，超聲波振蕩提取2min，8000r/min勻漿提取30s，4000r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)移至25mL比色管中;另取一50ml離心管加入11mL乙腈，洗滌勻漿刀頭10s，洗滌液移入前一離心管中，用玻棒搗碎離心管中的沉淀，漩渦混勻器上振蕩30s，超聲波振蕩5min，4000r/m

38、in離心5min，上清液合并至25mL比色管中，用乙腈定容至25.0mL，搖勻備用。</p><p><b>　　2.4.2凈化</b></p><p>　　移取5.00mL樣品溶液加至已活化的中性氧化鋁柱（2.2.6）上，用雞心瓶接收流出液，4mL乙腈洗滌中性氧化鋁柱，收集全部流出液，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用2mL的乙腈-5mmol/L乙酸銨（1+1）溶解，超聲振蕩2

39、min，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。</p><p>　　2.5超高效相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜上機(jī)分析測(cè)定</p><p>　　研究采用了超高效液相色譜儀和1.7μm填料的超高效液相色譜柱對(duì)樣品進(jìn)行分離，與傳統(tǒng)的高效液相色譜柱相比，該法能更好地使待測(cè)物與抑制電離的基質(zhì)分離，降低基質(zhì)對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)的影響，同時(shí)提高分離效率。對(duì)于電噴霧離子源正離子掃描模式，流動(dòng)相在弱酸性環(huán)境條件下加入

40、適量乙酸銨可以提高待測(cè)物離子化效率，因此，試驗(yàn)中采用乙腈和5 mmol乙酸銨溶液(pH=4.5)作為流動(dòng)相體系，并且對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，當(dāng)乙腈和乙酸銨溶液初始比例為50:50梯度洗脫條件下(表1)，待測(cè)物在3min內(nèi)全部出峰，并且靈敏度高、分離效果好，滿足檢測(cè)要求。</p><p>　　2.5.1 超高效液相色譜條件</p><p>　　色譜柱為ACQUITY UPLCTM B

41、EH C18柱(2.1mm×100 mm，1.7μm)；流動(dòng)相：溶劑A為乙腈，溶劑B為5 mmol乙酸銨溶液(pH4.5)，梯度洗脫條件見表1；樣品室溫度10℃ ；色譜柱溫40℃；進(jìn)樣體積10μL；流速0.3 mL/min。</p><p><b>　　表1 梯度洗脫條件</b></p><p>　　Table 1 Gradient elution con

42、ditions</p><p><b>　　2.5.2質(zhì)譜條件</b></p><p>　　電噴霧離子源ESI+；毛細(xì)管電壓3.5 kV；二級(jí)錐孔電壓3.0V，離子源溫度120℃；脫溶劑氣溫度380℃，錐孔氣流量50 L/h；脫溶劑氣流量600 L/h。第一重四極桿和第二重四極桿的低端分辨率及高端分辨率均為13.0；碰撞氣流量0.2 mL/min；錐孔電壓、碰撞能量及

43、監(jiān)測(cè)離子對(duì)見表2，檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描模式。</p><p>　　表2 MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜條件</p><p>　　Table 2 MRM conditions for multiple reaction monitoring mass spectrometry</p><p>　　2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定</p><p>

44、;　　按照表1和表2的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件測(cè)定不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按內(nèi)標(biāo)法定量并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和計(jì)算相關(guān)系數(shù)。</p><p>　　2.5.4 樣品測(cè)定</p><p>　　按照表1和表2的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件測(cè)定樣品溶液，計(jì)算樣品溶液中非定量離子對(duì)與定量離子對(duì)色譜峰面積的比值，并與標(biāo)準(zhǔn)品比較，僅當(dāng)兩者數(shù)值的相對(duì)偏差小于25%時(shí)方可確定兩者為同一物質(zhì)。</p&

45、gt;<p>　　2.6結(jié)果計(jì)算和表述 </p><p>　　按式（1）計(jì)算樣品中孔雀石綠與隱色孔雀石綠殘留量。計(jì)算結(jié)果需扣除空白值。 </p><p>　　C×Ci×A×Asi×V ...</p><p>　　X= —————————— （1）</p><p>　　Csi

46、5;Ai×As×W ... </p><p><b>　　式中： </b></p><p>　　X ── 樣品中待測(cè)組分殘留量，μg/kg； </p><p>　　C ── 孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度，μg/L； </p><p>　　Csi ── 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)

47、標(biāo)物的濃度，μg/L； </p><p>　　Ci── 樣液中內(nèi)標(biāo)物的濃度，μg/L；</p><p>　　As ── 孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的峰面積； </p><p>　　A ── 樣液中孔雀石綠的峰面積；</p><p>　　Asi ── 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積； </p><p>　　Ai ──

48、 樣液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積； </p><p>　　V ── 樣品定容體積，mL； </p><p>　　W ── 樣品稱樣量，g ； </p><p><b>　　3. 結(jié)果與討論</b></p><p>　　3.1 UPLC-MS/MS分析</p><p>　　采用電噴霧離子源，正離

49、子掃描模式，分別對(duì)MG、LMG和MG-D5、LMG-D6監(jiān)測(cè)其母離子和2個(gè)信號(hào)較強(qiáng)的子離子，以母離子和子離子組成監(jiān)測(cè)離子對(duì)，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定性和定量分析。在上述儀器分析條件下孔雀石綠、氘代孔雀石綠的參考保留時(shí)間分別為1.03min、2.92min。1ng/mL的孔雀石綠和隱色孔雀石綠混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰如圖1所示。</p><p>　　圖1. 1ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖</p><

50、;p>　　Figure 1. 1ng/ml of the standard chromatogram</p><p>　　3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性和檢出限</p><p>　　空白魚肉樣品作基質(zhì)，加入最終測(cè)定質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20ng/mL的MG和LMG混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(相當(dāng)于樣品中添加0.5、1.0、2.0、4.0、10.0和20.0μg/kg的待測(cè)物)，

51、 加入200μL濃度為100ng/mL的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品前處理方法后進(jìn)行上機(jī)測(cè)試，試驗(yàn)結(jié)果以標(biāo)樣質(zhì)量濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)，以MG和LMG的標(biāo)準(zhǔn)峰面積與內(nèi)標(biāo)MG-D5(LMG-D6)的峰面積之比值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表3。以10倍信噪比計(jì)算檢測(cè)限，MG、LMG檢出限均為0.5μg/kg，檢測(cè)限加標(biāo)圖譜見圖2、圖3。</p><p>　　圖2. 孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)曲線圖</p

52、><p>　　Figure 2. the standard curve of Malachite green</p><p>　　圖3. 隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)曲線圖</p><p>　　Figure 3. the standard curve of LMG</p><p>　　表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)</p><p

53、>　　Table 3 regression equation of the Standard curve and correlation coefficient</p><p>　　從標(biāo)準(zhǔn)曲線圖和回歸方程及相關(guān)系數(shù)可以看出，MG和LMG在0.5—20.0ng/mL的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，線性范圍寬，可很好地用于定量檢測(cè)。</p><p>　　圖4. 空白魚肉樣品檢測(cè)限（0.5μg/

54、kg）加標(biāo)色譜圖</p><p>　　Figure 4. Blank fish sample detection limit (0.5μg/kg) spiked chromatogram</p><p>　　從圖4中可以看出，在檢測(cè)限加標(biāo)下，基質(zhì)干擾小，峰形好，色譜響應(yīng)高，信號(hào)與基線噪音的響應(yīng)比大于10，完全能夠達(dá)到0.5μg/kg的檢測(cè)限要求。</p><p>　

55、　3.3 回收率與精密度</p><p>　　以草魚、大黃魚和對(duì)蝦空白樣品為實(shí)驗(yàn)材料，向空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)品，添加濃度水平為0.10、0.50、1.00、2.00和4.00 g/kg，然后按照上述方法進(jìn)行提取、凈化、測(cè)定，以內(nèi)標(biāo)法計(jì)算來驗(yàn)證方法的回收率。方法的回收率和精密度列于表4、表5和表6。</p><p>　　表4 草魚空白樣品中孔雀石綠的加標(biāo)回收測(cè)定結(jié)果</p>&

56、lt;p>　　Table 4 Determination of spike </p><p>　　recovery results of malachite green in the blank sample of Grass carp </p><p>　　表5 大黃魚空白樣品中孔雀石綠的加標(biāo)回收測(cè)定結(jié)果</p><p>　　Table 5 croak

57、er the blank sample of large </p><p>　　yellow spiked recovery of malachite green in the determination of results</p><p>　　表6 對(duì)蝦空白樣品中孔雀石綠的加標(biāo)回收測(cè)定結(jié)果</p><p>　　Table 6 the blank sample

58、 of</p><p>　　shrimp spiked recovery of malachite green in the determination of results</p><p>　　從上述結(jié)果可以看出，在0.5—10.0ug/kg加標(biāo)濃度下，MG和LMG的回收率差別不大，草魚空白樣品添加MG和LMG的平均回收率分別為90.55％—93.02％、89.17%—95.42%；大黃

59、魚空白樣品添加MG和LMG的平均回收率分別為88.73％—92.77％、91.6%—92.22%；對(duì)蝦空白樣品添加MG和LMG的平均回收率分別為88.9％—92.83％、86.45%—90.52%，這說明基質(zhì)效應(yīng)對(duì)本實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果影響不大。在不同樣品的不同添加水平下，RSD值均在10％以下，說明本實(shí)驗(yàn)方法精密度好，準(zhǔn)確度高。</p><p>　　另每天分別取6份空白草魚和6份空白對(duì)蝦樣品分別進(jìn)行添加水平為0.5μ

60、g/kg、2.0 μg/kg和10.0μg/kg的加標(biāo)回收率測(cè)定，連續(xù)測(cè)定三天，計(jì)算批間精密度。批間精密度結(jié)果見表7。</p><p><b>　　表7 批間精密度</b></p><p>　　Table 7 precision between Different samples and different time</p><p>　　由

61、實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知各添加水平批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于8%，說明該方法用于水產(chǎn)品孔雀石綠的檢測(cè)重復(fù)性好，精密度和回收率均較高。</p><p><b>　　3.4 色譜圖</b></p><p>　　空白草魚樣品和2.0μg/kg加標(biāo)樣品后的色譜圖見圖5和圖6所示。</p><p>　　圖5. 草魚空白樣品色譜圖</p><p>

62、　　Figure 5. chromatogram of Carp blank sample</p><p>　　圖6.草魚空白樣品2.0μg/kg加標(biāo)色譜圖</p><p>　　Figure 6. Chromatogram of Grass carp spiked blank sample 2.0μg/kg</p><p>　　從圖5和圖6可以看出，在2.0μ

63、g/kg的加標(biāo)下，草魚樣品加標(biāo)色譜峰形好，基質(zhì)干擾小。</p><p><b>　　4. 討論</b></p><p>　　4.1 方法選擇及改進(jìn)</p><p>　　目前，國內(nèi)同時(shí)檢測(cè)MG及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)方法有GB/T 19857-2005和GB/T 20361-2006和SN/T 1768-2006等，但SN/T 1768-2006和GB/

64、T 20361-2006存在檢測(cè)方法繁瑣，特別是前處理操作步驟多、耗時(shí)較長、費(fèi)用高及檢測(cè)過程使用大量有毒試劑等缺點(diǎn)，因此，筆者采用GB/T19857-2005快速檢測(cè)方法進(jìn)行水產(chǎn)品出口檢測(cè)。然而，由于待測(cè)物的不穩(wěn)定性，完全采用GB/T19857-2005方法檢測(cè)，其MG回收率偏低，而LMG回收率偏高，不能滿足檢測(cè)要求。該法在應(yīng)用GB/T19857-2005檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，采用空白樣品添加不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的方式繪制校準(zhǔn)曲線，以最大限

65、度排除基體干擾。同時(shí)定量方法采用MG-D5和LMG-D6為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)，降低由于前處理過程中目標(biāo)化合物的損失所帶來的偏差，從而提高定量的準(zhǔn)確性，加標(biāo)回收率穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，整個(gè)檢測(cè)過程僅需30min左右。</p><p>　　4.2 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的校準(zhǔn)及測(cè)定條件優(yōu)化</p><p>　　儀器的狀態(tài)會(huì)影響到測(cè)定結(jié)果的可靠性。一般情況先采用廠商提供的PPG校準(zhǔn)試劑按照特定的方

66、法進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的校準(zhǔn)。在每次實(shí)驗(yàn)前采用2.5g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行自校準(zhǔn)，以了解其狀態(tài)是否處于正常。 </p><p>　　由于被測(cè)物進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器時(shí)，首先需要離子化，離子化的程度直接影響到分析結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確度，因此，必須先對(duì)每一種被測(cè)物的質(zhì)譜條件進(jìn)行全面優(yōu)化。用高濃度(2.0μg/mL )的MG、LMG和內(nèi)標(biāo)MG-D5、LMG-D6的標(biāo)準(zhǔn)溶液以流動(dòng)注射的方式在正離子模式下對(duì)4

67、種物質(zhì)進(jìn)行母離子全掃描確定MG、LMG和內(nèi)標(biāo)MG-D5、LMG-D6的m+1離子分別為m/z 329.2、m/z 331.2、m/z 334.2和m/z 337.2。然后，分別以所得的m/z數(shù)為母離子，對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描.從MG及LMG子離子掃描圖中選取2個(gè)子離子，從內(nèi)標(biāo)MG-D5及LMG-D6子離子掃描圖中選取1個(gè)子離子，進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、二級(jí)錐孔電壓、碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù)，其中以碰撞電壓對(duì)離子對(duì)的豐

68、度影響最大。接著優(yōu)化脫溶劑氣和錐孔氣等參數(shù)，從而獲得上述測(cè)定條件。</p><p>　　4.3 樣品中孔雀石綠提取條件的優(yōu)化</p><p>　　目前報(bào)道的水產(chǎn)品中孔雀石綠提取溶劑是單一乙腈溶液、乙腈-乙酸銨混合溶液等。本人比較了乙腈-乙酸銨混合溶液和單一乙腈溶液的提取效率，發(fā)現(xiàn)單一乙腈溶液提取方法操作簡(jiǎn)便，且回收率較高，在70%以上，與乙腈-乙酸銨混合溶液的提取效率無顯著差別，因此選用單

69、一乙腈溶液作為提取溶劑。此外，通過在空白草魚樣品中添加了2.00μg/kg的目標(biāo)化合物來比較不同提取次數(shù)對(duì)回收率的影響。分別比較了1次提取、2次提取和3次提取，測(cè)定結(jié)果見表8。我們發(fā)現(xiàn)3次提取效果最好，2次提取效果其次，1次提取效率最低。比較3次提取和2次提取的數(shù)值，兩者差別不大，考慮檢測(cè)成本和時(shí)效性，我們選用2次提取方式。</p><p>　　表8 不同次數(shù)對(duì)孔雀石綠和隱色孔雀石綠回收率的影響</p>

70、;<p>　　Table 8 Different times of recovery of the impact of malachite green and LMG</p><p>　　4.4 魚肉樣品的保存</p><p>　　由于孔雀石綠容易分解，因此，樣品的儲(chǔ)存條件對(duì)檢測(cè)結(jié)果有一定的影響。比較了添加濃度為2.00μg/kg的 草魚樣品在4℃和-18℃兩種不同保存溫度

71、條件下，不同保存天數(shù)對(duì)孔雀石綠和隱色孔雀石綠回收率的影響效果。測(cè)定結(jié)果見表9。</p><p>　　表9 不同樣品保存條件下孔雀石綠和隱色孔雀石綠的回收率(n=3)</p><p>　　Table 9 different samples under storage </p><p>　　conditions of malachite green and leuco

72、 malachite green recovery (n = 3)</p><p>　　從表9中可以看出，在不同保存溫度下，不同的保存天數(shù)對(duì)孔雀石綠和隱色孔雀石綠的回收率影響非常大。在4℃保存條件下，孔雀石綠和隱色孔雀石綠的回收率隨著保存天數(shù)的延長而顯著下降；而在-18％保存條件下，孔雀石綠和隱色孔雀石綠的回收率隨著保存天數(shù)的延長并未呈現(xiàn)出顯著下降現(xiàn)象。這說明了孔雀石綠和隱色孔雀石綠在4℃下是非常不穩(wěn)定的。因此，

73、樣品應(yīng)保存在-18℃以下。</p><p>　　4.5 樣品溶液放置時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響</p><p>　　由于MG及其代謝物的不穩(wěn)定性，文章研究了樣品溶液放置時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。研究比較了2種待測(cè)物平均添加水平為3.0μg/kg的魚肉樣品處理完后在10℃下避光放置0、30、60min及6h、12 h檢測(cè)對(duì)回收率的影響。結(jié)果顯示，MG在研究時(shí)間內(nèi)對(duì)放置時(shí)間影響較小，而LMG回收率隨著放

74、置時(shí)間的延長而呈下降趨勢(shì)。與樣品處理好后及時(shí)上機(jī)相比，LMG在放置30、60 min及6、12 h后檢測(cè)的回收率分別下降了13％ 、24％ 、30％ 和34％，因此，為了保證檢測(cè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，樣品前處理時(shí)間不宜太長，樣品處理完后應(yīng)及時(shí)上機(jī)檢測(cè)，可考慮對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液進(jìn)行穿插進(jìn)樣檢測(cè)，特別是檢測(cè)隱色代謝物。同時(shí)為了保證檢測(cè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，檢測(cè)過程也應(yīng)注意以下事項(xiàng)：1)整個(gè)檢測(cè)過程要盡量避光，防止待測(cè)物降解；2)標(biāo)準(zhǔn)貯備液應(yīng)在-18℃

75、以下避光保存，有效期3個(gè)月，混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用；3)檢測(cè)過程避免交叉污染，包括樣品之間、樣品與標(biāo)準(zhǔn)溶液之間等。</p><p><b>　　5. 小結(jié)</b></p><p>　　超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜是痕量分析中分離鑒定熱不穩(wěn)定化合物的強(qiáng)有力工具。本實(shí)驗(yàn)建立的方法中，采用陽離子交換柱和同位素內(nèi)標(biāo)法定量，有效消除了基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響。所建立的方法能同時(shí)分離

76、鑒定水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠殘留，且重復(fù)性和準(zhǔn)確性好，檢出限為0.10μg/kg，優(yōu)于現(xiàn)行有效的方法檢出限，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，減少了有機(jī)溶劑用量，是水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠殘留總量快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，該方法完全滿足水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留檢出的要求。</p><p><b>　　[參 考 文 獻(xiàn)]</b></p><p>　　[1] 劉海新

77、等.水產(chǎn)品中孔雀石綠檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].福建水產(chǎn)，2007．</p><p>　　[2] 翟毓秀，郭瑩瑩，耿霞，等.孔雀石綠代謝機(jī)理及生物毒性研究進(jìn)展口].中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2007．</p><p>　　[3] 邱緒建，林洪，王聯(lián)珠，等．孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物無色孔雀石綠在鯽魚肌肉中的代謝[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2006．</p><p>　　[4] 曲志娜等

78、.孔雀石綠及其代謝物在大菱蚌肌肉中的消除規(guī)律，2008．</p><p>　　[5] 高露姣，蔡友瓊，姜朝軍，等.孔雀石綠及其主要代謝產(chǎn)物在歐洲鰻鱺肌肉中蓄積及消除規(guī)律[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2007．</p><p>　　[6] 揚(yáng)先樂，喻文娟，王民權(quán)，等.對(duì)孔雀石綠的禁用及思考[J].水產(chǎn)科技情報(bào)，2005．</p><p>　　[7] 龔朋飛，王權(quán)，陳永軍，等.孔雀

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