斜紋夜蛾核型多角體病毒ⅡORF59基因的分析.pdf

1、桿狀病毒(Baculovirus)是節(jié)肢動(dòng)物,特別是鱗翅目昆蟲重要的病原微生物,在重要農(nóng)林害蟲的生物防治中具有廣闊的應(yīng)用前景,具有化學(xué)殺蟲劑無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。桿狀病毒的分子生物學(xué)研究已取得了很大進(jìn)展。開發(fā)出的桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)、重組桿狀病毒殺蟲劑、桿狀病毒作為基因治療的載體、重組桿狀病毒表面展示系統(tǒng)為科學(xué)研究和實(shí)際運(yùn)用作出了巨大貢獻(xiàn)。斜紋夜蛾核型多角體病毒Ⅱ(SpltMNPVⅡ),是2004年由Kamiya等在日本分離得到的一種新發(fā)現(xiàn)的

2、繁殖率和毒力極強(qiáng)的病毒株。其宿主斜紋夜蛾(Spodoptera litura,Spli)是鱗翅目夜蛾科的雜食性害蟲,分布范圍廣,是我國糧棉、油等經(jīng)濟(jì)作物和蔬菜的重要害蟲之一。應(yīng)用SpltMNPVⅡ防治斜紋夜蛾是一種有效的生物防治方法,而通過基因工程手段構(gòu)建新的高效殺蟲病毒是改良生物病毒殺蟲劑的重要途徑。SpltMNPVⅡ全基因組序列已經(jīng)測定,共149個(gè)ORFs。其中一些基因的功能已闡明,但還有許多基因的功能尚不清楚。在SpltMNPVⅡ

3、和其它已報(bào)道的桿狀病毒的同源基因中,ORF59尚沒有研究報(bào)道過,且質(zhì)譜分析表明該基因位于ODV中。本研究對ORF59基因進(jìn)行了結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特性的初步研究,主要工作及成果如下:
　　 ⑴克隆了SpltMNPVⅡORF59基因,該基因編碼區(qū)含645bp,編碼分子量為25.4kD的多肽(GenBank登錄號:NC_011616)。分析了該基因的核苷酸和氨基酸序列特征,并進(jìn)行了ORF59蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,初步推測該基因可能與基因表達(dá)調(diào)

4、控以及病毒粒子的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。
　　 ⑵表達(dá)并制備了ORF59蛋白的兔多克隆抗體。將orf59基因克隆至原核表達(dá)載體pET28a(+),經(jīng)IPTG誘導(dǎo),SDS-PAGE顯示該蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得了表達(dá),并且誘導(dǎo)4小時(shí)表達(dá)量最高,同時(shí)進(jìn)行了western blot鑒定。orf59基因在大腸桿菌中原核表達(dá)后,純化融合的目的蛋白,并肌肉注射,免疫新西蘭大白兔制備兔多抗。免疫雙擴(kuò)散測定抗體效價(jià),結(jié)果表明制備的多抗效價(jià)良好,

5、可以作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用。
　　 ⑶對orf59基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)相及其基因產(chǎn)物的定位進(jìn)行了分析。收集感染SpltMNPVⅡ不同時(shí)間點(diǎn)的Spli細(xì)胞,提取總RNA后用orf59特異性引物進(jìn)行RT-PCR和Realtime-PCR,分析其轉(zhuǎn)錄規(guī)律。結(jié)果顯示,在早期和晚期二者均能檢測到轉(zhuǎn)錄本,從病毒感染后3h就開始轉(zhuǎn)錄,一直持續(xù)到72h,這與序列分析顯示該基因是早晚期基因的結(jié)果一致。分離純化病毒粒子BV和ODV后,利用制備的兔多克隆抗體檢測O

6、RF59蛋白的表達(dá)情況,western blot結(jié)果顯示該基因定位于ODV中,與質(zhì)譜分析結(jié)果一致。
　　 ⑷構(gòu)建了以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(egfp)為標(biāo)記的、orf59失活的重組斜紋夜蛾核型多角體病毒。分別擴(kuò)增出orf59讀碼框上下游的不同片段及pph啟動(dòng)子啟動(dòng)的egfp,將三個(gè)片段按順序克隆進(jìn)pUC19載體,構(gòu)建了轉(zhuǎn)移載體p△orf59-egfp。將p△orf59-egfp與野生型SpltMNPVⅡDNA共轉(zhuǎn)染Spli細(xì)胞,