豬ACTN3基因功能的初步研究.pdf

1、近年來，本實(shí)驗(yàn)室利用抑制消減雜交技術(shù)、mRNA差異顯示技術(shù)、基因芯片和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出大量的在豬中差異表達(dá)的基因，還有待進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。ACTN3基因是我室利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選鑒定出來的在梅山豬背最長肌中不同時(shí)期差異表達(dá)的基因之一，本研究對(duì)該基因作了進(jìn)一步研究，取得的結(jié)果如下：
　　 1.獲得豬ACTN3基因整合cDNA全長2875bp，共21個(gè)外顯子，其中ORF為2709bp,編碼902個(gè)氨基酸，還獲得部分基因組DNA

2、序列5176bp，并分析了其基因結(jié)構(gòu)，其內(nèi)含子和外顯子的剪切方式都符合GT-AG規(guī)則。
　　 2.通過生物信息學(xué)方法對(duì)ACTN3基因的基因結(jié)構(gòu)、所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及功能等特征進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析，并構(gòu)建了分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。
　　 3.運(yùn)用半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)ACTN3基因進(jìn)行了組織表達(dá)譜分析，結(jié)果表明：ACTN3在脂肪、背最長肌、股二頭肌、半腱肌、咬肌五個(gè)組織中高表達(dá)，在肺里有較低表達(dá)，在肝臟中微弱表達(dá)，在其他組織中(心

3、、脾、腎、胃、睪丸)幾乎不表達(dá)。
　　 4.運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)ACTN3基因在大白、梅山豬背最長肌中進(jìn)行了時(shí)空表達(dá)譜分析，結(jié)果表明：ACTN3基因在大白豬、梅山豬出生后3d、21d、60d、120d、180d這五個(gè)時(shí)期均有表達(dá)。大白豬中，ACTN3的表達(dá)量從出生后3d到60d，逐漸增加達(dá)到恒定，直到180d，基本保持不變；梅山豬中，從出生后3d到21d，，ACTN3的表達(dá)量增加且達(dá)到最大值，之后到120d持續(xù)下降，到180

4、d時(shí)有所增加。ACTN3的表達(dá)量在梅山豬中3d和21d兩個(gè)時(shí)期間差異顯著(P＜0.05)，在大白豬中時(shí)期差異不顯著。
　　 5.對(duì)ACTN3基因的2個(gè)SNP位點(diǎn)在不同豬品種中進(jìn)行了基因頻率和基因型頻率檢測(cè)，并在2003年和2004年大白×梅山豬F2代資源家系中與肉質(zhì)性狀、胴體性狀進(jìn)行了相關(guān)分析，結(jié)果表明：在肉質(zhì)性狀方面，第11外顯子G418A位點(diǎn)(PCR-TspEⅠ-RFLP)與系水力、股二頭肌大理石紋評(píng)分和肌內(nèi)水分顯著相關(guān)(P

5、＜0.05)，第19內(nèi)含子A512G位點(diǎn)(PCR-SacⅡ-RFLP)與股二頭肌pH、頭半棘肌pH顯著相關(guān)(p＜0.05)；在胴體性狀方面，G418A位點(diǎn)與肥肉率、屠宰率、6-7腰椎間背膘厚、胸腰椎間背膘厚極顯著相關(guān)(P＜0.01)，與平均背膘厚和肥瘦肉比例顯著相關(guān)(P＜0.05)；A512G位點(diǎn)與屠宰率、6-7腰椎間背膘厚、平均背膘厚極顯著相關(guān)(P＜0.01)，與胸腰椎間背膘厚、臀部平均背膘厚、肥瘦肉比例、眼肌高呈顯著相關(guān)(P＜0.0

6、5)。
　　 6.采用PCR方法擴(kuò)增了ACTN3基因5’側(cè)翼1724bp的序列，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)
　　 了豬ACTN3基因的核心啟動(dòng)子區(qū)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、CpG島的分布及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
　　 7.結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果，采用5’端系統(tǒng)缺失的方法，成功構(gòu)建了8個(gè)豬ACTN3基
　　 因啟動(dòng)子區(qū)的重組表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染豬PK15細(xì)胞，利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)了它們的活性，結(jié)果表明：構(gòu)建的8個(gè)重組子的