受水楊酸誘導的甜橙GSTU19基因啟動子的分離和功能驗證.pdf

1、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)是生物體內(nèi)廣泛存在的一類可溶性蛋白，它們由一個龐大的基因家族編碼。根據(jù)它們的基因序列特征可以把GSTs分為七大類：Phi、Tau、Theta、Zeta、Lambda、DHAR(脫氫抗壞血酸還原酶)和TCHQD(四氯對苯二酚脫鹵素酶)。其中Tau類GSTs(GSTU)為植物所特有，并且在抵抗脅迫和次級代謝等生理過程中發(fā)揮著重要作用。前人研究發(fā)現(xiàn)GSTs可受到多種因素誘導，水楊酸(SalicylicAcid,

2、SA)可以誘導其早期啟動與表達。本研究擬根據(jù)其早期啟動表達受SA誘導的特性，分離SA誘導型啟動子，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生物學研究提供一個可控的表達調(diào)控元件。本研究以臍橙為材料，采用SA對其葉片進行處理，分離克隆上調(diào)表達GSTU19基因，繼而用染色體步移的方法分離出其啟動子，通過啟動子元件分析軟件掃描，發(fā)現(xiàn)該啟動子序列中存在多種與誘導表達相關(guān)的調(diào)控元件。為了進一步證實該啟動子功能，構(gòu)建了3個該啟動子序列缺失的表達載體，并通過多種遺傳轉(zhuǎn)化方法對其進

3、行驗證。主要結(jié)果如下：
　　 1.甜橙CiGSTU19受SA誘導表達。熒光定量PCR實驗結(jié)果顯示：5mmol/LSA處理紅肉臍橙葉片后,葉片中CiGSTU19RNA的表達量水平在8小時內(nèi)快速上升，隨后又回復到正常狀態(tài)。結(jié)果表明GSTU19能快速響應(yīng)SA的刺激，在完成SA的信息傳輸后又恢復到正常的表達水平。因此，初步推測CiGSTU19啟動子可以受SA誘導而啟動表達。
　　 2.CiGSTU19啟動子的克隆和分析發(fā)現(xiàn)CiG

4、STU19啟動子中有多種與SA誘導相關(guān)的元件。使用染色體步移的方法克隆了CiGSTU19的啟動子，通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)CiGSTU19的啟動子中存在著多種與SA誘導相關(guān)的元件，如被WRKY轉(zhuǎn)錄因子所結(jié)合的W-box、能被bZIP類蛋白所識別的ACGT元件以及ARR1結(jié)合元件等。
　　 3.CiGSTU19啟動子序列缺失載體構(gòu)建。為了進一步驗證該啟動子受水楊酸誘導，本研究設(shè)計了一系列該啟動子序列缺失的表達載體，2個較短插入片段(

5、400bp、700bp)的pCAMBIA1391系列載體成功轉(zhuǎn)化到擬南芥中。GUS組織染色結(jié)果表明，300bp的啟動子序列已經(jīng)具備啟動轉(zhuǎn)錄功能；另序列分析的結(jié)果顯示-300bp～+118bp的啟動子序列中含有3個CaMV35S啟動子中的GATA元件；這結(jié)果說明，CiGSTU19啟動子的300bp片段已經(jīng)是一個強啟動子。原生質(zhì)體瞬時表達和水楊酸誘導處理實驗結(jié)果顯示，不論是GFP還是GUS的表達都受水楊酸誘導影響，說明-700bp啟動子插入

6、片段可能含有水楊酸誘導相關(guān)元件。
　　 4.瞬時轉(zhuǎn)化方法的摸索。本研究試驗了多種瞬時表達方法：農(nóng)桿菌介導的注射葉片法、農(nóng)桿菌介導的真空滲透法、原生質(zhì)體瞬時表達等。前兩者的GUS組織染色實驗沒有著色，結(jié)果都不理想。分析原因可能是這兩種方法的轉(zhuǎn)化率都不高，菌液只是進入了植物組織間隙，而沒有進入細胞內(nèi)，無法為基因提供一個合適的環(huán)境進行基因的表達。原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率比較高，而且整個實驗過程較短，只需要2-3天的時間，是一個較理想的瞬時轉(zhuǎn)