兔支氣管敗血波氏桿菌單克隆抗體的制備及雙夾心ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、支氣管敗血波氏桿菌（Bordetella bronchiseptica，Bb）是一種重要的病原菌，可廣泛感染家畜、野生動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物呼吸道上皮，能引起豬、馬、貓、狗、兔、小鼠、豚鼠等哺乳動(dòng)物的呼吸道疾病，常導(dǎo)致感染動(dòng)物發(fā)生鼻炎和支氣管肺炎。人也有感染該菌的報(bào)道，尤其是小孩和免疫力缺陷的人群。該菌在兔群中感染率非常高，危害家兔健康，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)兔質(zhì)量和科學(xué)研究。
　　 目前，國(guó)內(nèi)外在豬萎縮性鼻炎的研究中，對(duì)波氏桿菌的研究較為深入，

2、但對(duì)家兔波氏桿菌的研究較少，對(duì)其檢測(cè)方法的報(bào)道更少，特別是到目前為止，國(guó)內(nèi)外有關(guān)兔波氏桿菌單克隆抗體的研究仍未見(jiàn)報(bào)道。
　　 鑒于單抗在疾病的診斷、防治方面具有無(wú)可比擬的優(yōu)越性，本文制備了該菌的單克隆抗體并建立了該菌的ELISA檢測(cè)方法。主要試驗(yàn)和結(jié)果如下：
　　 1.以Bb分離株BLJ05的滅活菌液為免疫原，腹腔免疫BALB/c小鼠，采用常規(guī)雜交瘤技術(shù)制備Bb單克隆抗體（McAb），結(jié)果獲得兩株能穩(wěn)定分泌抗Bb單克隆抗

3、體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為A7D5和D6B2。用間接ELISA、Western-blot等方法對(duì)所制備的McAb特性進(jìn)行鑒定。兩株雜交瘤細(xì)胞株A7D5和D6B2小鼠腹水抗體效價(jià)分別為1:409600和1:102400；且不與兔大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等兔的常見(jiàn)病原菌反應(yīng)，特異性強(qiáng)。兩株單抗親和力實(shí)驗(yàn)表明雜交瘤細(xì)胞株A7D5親和力略高于D6B2。ELISA相加試驗(yàn)表明它們針對(duì)相同的抗原表位。該雜交瘤細(xì)胞株的獲得為今后兔支氣

4、管敗血波氏桿菌的診斷、防治和流行病學(xué)調(diào)查等奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.以Bb分離株BLJ05為免疫原，制備兔抗Bb免疫血清，將其IgG提純，并利用第一章制備的單克隆抗體建立Bb雙夾心ELISA檢測(cè)方法。以兔抗Bb IgG鋪板，用方陣法篩選兩種抗體最佳反應(yīng)濃度；用特異性試驗(yàn)、敏感性試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)對(duì)該方法進(jìn)行鑒定，并與PCR檢測(cè)方法比較。結(jié)果顯示，免疫血清IgG的最佳稀釋度為1:6400，濃度為2.5 mg/L；單抗IgG的最佳稀釋度