鴨腸炎病毒核衣殼蛋白基因結(jié)構(gòu)與功能初步研究.pdf

1、[目的]：
　　通過對鴨腸炎病毒(DEV)核衣殼蛋白(NP)基因的克隆與表達(dá)分析，并從核苷酸和氨基酸水平上初步探索DEVNP蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，為DEV致病機理深入研究奠定基礎(chǔ)和提供科學(xué)依據(jù)。
　　[方法]：
　　(1)以鴨腸炎病毒GZ株基因組為模板，通過PCR方法擴增該基因并將其克隆到pMD18-T載體上，構(gòu)建NP重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，對經(jīng)PCR和酶切鑒定為陽性的重組菌進(jìn)行序列測定。
　　(2)根據(jù)

2、測定的DEVNP基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列，應(yīng)用生物學(xué)軟件對NP蛋白的二級結(jié)構(gòu)、親水性、抗原指數(shù)、柔韌性、表面可及性以及保守結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)、磷酸化、糖基化、信號肽、亞細(xì)胞定位及三級結(jié)構(gòu)等多方面進(jìn)行了分析和預(yù)測。
　　(3)以含DEVNP基因的重組質(zhì)粒pMD18-T-NP為模板，應(yīng)用PCR方法擴增得到NP基因，克隆至原核表達(dá)載體pET-32a(＋)，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-32a-NP，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行

3、誘導(dǎo)表達(dá)研究。
　　(4)應(yīng)用生物軟件EMBOSS軟件包的CHIPS和CUS程序?qū)EVNP基因的密碼子使用情況進(jìn)行分析，并與不同表達(dá)宿主如大腸桿菌、酵母和鴨等的密碼子偏愛性進(jìn)行比較。
　　[結(jié)果]：
　　(1)將擴增得到的克隆到pMD18-T載體后，經(jīng)PCR鑒定可見一條與預(yù)期大小相一致(891bp)的DNA條帶；采用BamHI與EcoRI進(jìn)行雙酶切后，可見2700bp大小的載體條帶和890bp大小的目的條帶；取陽性重

4、組質(zhì)粒進(jìn)行測序，目的片段大小為891bp，其中含全長NP基因，為759bp，可編碼252氨基酸。
　　(2)應(yīng)用生物軟件對DEVNP基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該基因除了含一個完整的NP基因開放閱讀框外，還含有4個開放閱讀框；并含有1個保守結(jié)構(gòu)域，為Herpes_UL5；與其他α-皰疹病毒相應(yīng)序列具有較高的同源性；NP蛋白的主要抗原決定簇位于第8～19，104～112，165～170，194～208和237～245區(qū)段上；含有潛在的3個糖基

5、化位點和14個磷酸化位點；為不含信號肽的膜外蛋白，亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核上。
　　(3)通過雙酶切取含NP基因的片段(891bp)克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(＋)上，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-32a-NP，經(jīng)PCR、雙酶切和測序鑒定后，取陽性重組質(zhì)粒pET-32a-NP，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，采用不同濃度IPTG和不同誘導(dǎo)時間進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，但均未見到相應(yīng)的目的蛋白帶，即DEVNP基因未能在大腸桿菌中得到表達(dá)。
　　(4)運

6、用EMBOSS軟件包CHIPS和CUSP程序進(jìn)行分析顯示，DEVNP基因的ENC值為51.180，編碼NP蛋白的A、I等氨基酸不同密碼子的使用頻率存在一定的差異；從密碼子使用頻率比值上來看，大腸桿菌有22個、酵母有18個和鴨有12個密碼子與DEVNP基因存在較大的密碼子偏愛性。
　　[結(jié)論]：
　　(1)經(jīng)序列測定及其同源性分析表明，鴨腸炎病毒NP基因具有典型的α-皰疹病毒特征，與α皰疹病毒同屬于一類。
　　(2)經(jīng)生