鴨腸炎病毒gD蛋白亞細(xì)胞定位及其對(duì)病毒感染相關(guān)作用的研究.pdf

1、鴨病毒性腸炎(duck viral enteritis，DVE)，又名鴨瘟(duck plague，DP)，是鴨、鵝等多種雁形目禽類(lèi)的一種急性、熱性、敗血性傳染病。本病病原為鴨腸炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)，屬于皰疹病毒科，尚未定亞科及屬。皰疹病毒糖蛋白D(Glycoprotein D，gD)為病毒主要毒力蛋白，對(duì)病毒的侵入和病毒包膜及細(xì)胞膜的融合有一定的促進(jìn)作用。gD蛋白參與病毒的免疫逃避機(jī)制，與胞質(zhì)中的

2、TAP結(jié)合，阻斷MHC I類(lèi)分子的抗原呈遞途徑。針對(duì)gD蛋白的功能研究對(duì)進(jìn)一步了解病毒感染機(jī)理有重要理論意義。
　　 本研究以鴨腸炎病毒(DEV)C-KCE株的基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到us60RF，并對(duì)其進(jìn)行了詳盡的生物信息學(xué)分析，包括氨基酸同源性、編碼蛋白結(jié)構(gòu)等。利用原核表達(dá)系統(tǒng)pET30a(+)(E.coli Rosetta)，獲得大小約為47KDa的重組gD基因胞外區(qū)(gDw)蛋白。免疫家兔制備兔抗gDw蛋白高免血清，

3、血清瓊擴(kuò)效價(jià)為1:16，中和抗體效價(jià)為1:64。經(jīng)間接免疫熒光試驗(yàn)和Western blot分析證明此抗體針對(duì)DEV gD蛋白有良好的反應(yīng)性。
　　 對(duì)實(shí)時(shí)收獲的DEV感染后細(xì)胞裂解物提取總RNA，并進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)gD基因轉(zhuǎn)錄情況。DEV感染鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)后2h即可檢測(cè)出gD基因的轉(zhuǎn)錄，具有γ1基因的典型轉(zhuǎn)錄特征。以純化后的兔抗gDw IgG作為一抗，與病毒接種的DEF進(jìn)行間接免疫熒光反應(yīng)。4h核膜及核周囊泡首先

4、開(kāi)始出現(xiàn)特異性綠色熒光，12h以后新合成的gD廣泛存在于胞漿中，72h gD集中于細(xì)胞膜上。
　　 在接種DEV的DEF培養(yǎng)液中添加兔抗gDw IgG，分別檢測(cè)gD蛋白在病毒的吸附、侵入、細(xì)胞到細(xì)胞間的直接傳播中的作用，以及對(duì)病毒體外復(fù)制的影響。結(jié)果表明，加入抗gDwIgG試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，病毒侵入率及形成的噬斑大小有明顯差異，但是吸附率差異不明顯，說(shuō)明DEV gD參與病毒侵入和病毒在細(xì)胞間傳播的過(guò)程，對(duì)病毒的吸附作用無(wú)明顯影