山莨菪堿對脂多糖結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞及誘導(dǎo)no合成的抑制作用

1、<p>　　山莨菪堿對脂多糖結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞及誘導(dǎo)NO合成的抑制作用</p><p>　　【關(guān)鍵詞】 山莨菪堿 </p><p>　　關(guān)鍵詞: 山莨菪堿;內(nèi)皮，血管;脂多糖類;一氧化氮 </p><p>　　摘 要:目的 實驗觀察山莨菪堿對細(xì)菌脂多糖（LPS）結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞膜及誘導(dǎo)NO生成的影響. 方法 體外分離培養(yǎng)牛主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，用免疫組

2、化顯色反應(yīng)顯示細(xì)菌脂多糖與血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合，并通過圖像分析對結(jié)果進(jìn)行半定量;用高壓液相色譜分析細(xì)胞培養(yǎng)液中NO </p><p>　　3- 的含量，間接反應(yīng)NO的生成水平. 結(jié)果 細(xì)胞分組處理，間接法顯色后圖像分析，結(jié)果表明山莨菪堿組的平均灰度值明顯低于LPS組（P&lt;0.05）;并且對細(xì)胞培養(yǎng)液中NO </p><p>　　3- 的檢測顯示山莨菪堿組的濃度明顯低于LPS組

3、（P&lt;0.05）. 結(jié)論 山莨菪堿能夠抑制LPS結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞，并且能夠抑制LPS對NO合成的誘導(dǎo)作用. </p><p>　　Keywords:anisodamine;endothelium，vascular;lipopolysac-charides;nitric oxide </p><p>　　Abstract:AIM To investigate the effe

4、ct of anisodamine on lipopolysaccharides attached to the membrane of endothelium and inducing the releasing of nitric oxide（NO）.METHODS The bovine aortic endothelial cells（BAEC）were isolated and cultured for study.The li

5、popolysaccharides（LPS）at-tached to the membrane of endothelium was detected by im-munocytochemistric means.The NO 3- level which reflected the releasing of NO in culture medium was determined by high-performance liquid c

6、hromatography.RESULTS Af</p><p><b>　　0 引言 </b></p><p>　　研究與臨床實踐證明大劑量的山莨菪堿對于搶救內(nèi)毒素休克有效，其研究的結(jié)果表明其抗休克的作用機制主要在細(xì)胞水平上.近年對大腸桿菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）識別結(jié)合細(xì)胞膜上受體，引發(fā)各種病理生理過程的研究日漸深入.本實驗旨在通過

7、體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞，觀察山莨菪堿對LPS結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上受體以及誘導(dǎo)NO合成的影響，以此進(jìn)一步揭示山莨菪堿抗內(nèi)毒素休克的作用機制. </p><p><b>　　1 材料和方法 </b></p><p><b>　　1.1 材料 </b></p><p>　?、偎幤放c試劑:Ⅰ型膠原酶;正辛胺（n-octylamin

8、e）;大腸桿菌脂多糖E.coil O11B4（lipopolysaccharides，LPS，美國Sigma公司）;RPMT-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）;抗LPS單克隆抗體參照馬越云等［1］ 建立的方法制備;Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體與CD14單克隆抗體（武漢博士德生物技術(shù)公司）;辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（華美生物工程公司）;鹽酸消旋山莨菪堿（蕪湖長江藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號9806192）.地塞米松（天津藥業(yè)有

9、限公司）;②儀器設(shè)備:高壓液相色譜儀（美國Beckman公司）;CMIAS系列-多功能彩色病理圖像分析系統(tǒng)（北京航空航天大學(xué)圖像中心）. </p><p><b>　　1.2 方法 </b></p><p>　　①細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定:無菌條件下取牛主動脈血管10～15cm，管腔注入1g L-1 Ⅰ型膠原酶，37℃消化20min，收集消化液，離心洗滌細(xì)胞2次，計數(shù)，以1

10、×108 L-1 細(xì)胞數(shù)接種于含200g L-1 小牛血清的1640培養(yǎng)液，5mL L-1 CO 2 ，37℃條件下培養(yǎng)，胰酶消化傳代，實驗用6～10代細(xì)胞.培養(yǎng)細(xì)胞用Ⅷ因子相關(guān)抗原單克隆抗體檢測呈陽性;②內(nèi)皮細(xì)胞膜結(jié)合:LPS-sCD14復(fù)合物的檢測細(xì)胞均勻爬片，每8張一組，分4組:空白對照組，LPS組，山莨菪堿組，CD14抗體組.其中山莨菪堿組含山莨菪堿25mg L-1 ;CD14抗體組含抗CD14單克隆抗體3mg L-

11、1 .;除空白對照組以外，各組的培養(yǎng)液中均含LPS1.0mg L-1 .藥物在含200g L-1 小牛血清的1640培養(yǎng)液中作用4h后，40g L-1 中型甲醛固定細(xì)胞，抗LPS單克隆抗體（50mg L-1 ）檢測結(jié)合于細(xì)胞膜上的LPS，用間接法進(jìn)行免疫組化染色，由辣根過氧化物酶-DAB系統(tǒng)顯色.在CMIAS系列-多功能彩色病理圖像分析儀上進(jìn)行計算機輔助圖像分析;③細(xì)胞培養(yǎng)液的處理:細(xì)胞以2×10 5 /孔濃度均</p&

12、gt;<p><b>　　2 結(jié)果 </b></p><p>　　2.1 山莨菪堿對LPS結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響 </p><p>　　在CMIAS系列-多功能彩色病理圖象分析儀上，200倍視野下，每張片子分別隨機觀察記錄1個視野，記錄所測細(xì)胞的平均灰度值.灰度單位分為256個等級，LPS與血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合量與灰度值呈反比關(guān)系（Fig1（略））.

13、 </p><p>　　2.2 山莨菪堿對LPS誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞NO合成的影響 </p><p>　　NO的半衰期極短，很快被氧化為NO2- /NO3- ，并且NO2- 可進(jìn)一步氧化為NO3- （Tab1）. 表1 不同實驗組的細(xì)胞培養(yǎng)液中NO（略） </p><p><b>　　3 討論 </b></p><p>

14、　　G- 細(xì)菌引起感染性休克的主要致病因素為其菌體的LPS，進(jìn)入體內(nèi)后與血漿中的LBP蛋白、sCD14蛋白結(jié)合形成LPS-sCD14復(fù)合物，以復(fù)合物的形式與內(nèi)皮細(xì)胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合［3］ ，其中sCD14蛋白在LPS與其膜受體結(jié)合的過程中起關(guān)鍵性作用.相應(yīng)的CD14單克隆抗體可以有效的抑制LPS與其膜受體結(jié)合、誘導(dǎo)一系列的細(xì)胞反應(yīng)［4］ .本實驗中山莨菪堿表現(xiàn)了與CD14單克隆抗體類似的作用，能夠抑制LPS-sCD14復(fù)合物與血管內(nèi)皮細(xì)

15、胞的結(jié)合.LPS結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞可誘導(dǎo)其合成釋放大量的NO，使血管平滑肌的K+ 離子通道開放，平滑肌舒張，血壓下降，并使血管對兒茶酚胺的反應(yīng)性降低，這是造成內(nèi)毒素休克患者持續(xù)性低血壓的重要原因［5，6］ .實際上，用地塞米松、NG- 單甲基-L-精氨酸（L-NMMA）等藥物阻斷NO的生成可以明顯的改善內(nèi)毒素休克動物的持續(xù)低血壓狀態(tài)［7］ .山莨菪堿阻礙LPS-sCD14復(fù)合物與血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合必然對LPS誘導(dǎo)的NO生成具有抑制作用，從

16、而對內(nèi)毒素休克時的持續(xù)低血壓狀態(tài)起到改善作用，相應(yīng)的CD14單克隆抗體也在實驗中證明有相同的作用［8］ .由此實驗我們認(rèn)為，</p><p><b>　　參考文獻(xiàn): </b></p><p>　?。?］Ma YY，Ding ZR，Yu WB，Su MQ，Mu SJ.Cross-reactivities of Monocolonal antibodies against

17、 lipopolysaccharide-high densi-ty lipoprotein ［J］，J Cell Mol Immunol，1997;13（4）:61-72. </p><p>　　［2］Rizzo V，Montalbetti L，Rozza AL.Nitrite/nitrate balance dur-ing photoinduced cerebral ischemia in the rat de

18、termined by high-performance liquid chromatography with UV and electro-chemical detection ［J］.J Chromatogr A，1998;798（1-2）:103-108. </p><p>　　［3］Karima R，Matsumoto S，Higashi H.The molecular pathogene-sis of

19、endotoxic shock and organ failure ［J］.Mol Med Today，1999;5（3）:123-132. </p><p>　?。?］Wright SD.CD14and innate recognition of bacteria ［J］.J Im-munol，1995;155（1）:6-8. </p><p>　?。?］Parrillo JE.Path

20、ogenetic mechanisms of septic shock ［J］.N Engl J Med，1993;328（20）:1471-1478. </p><p>　　［6］Gross SS，Wolin MS.Nitric oxide:Pathophysiological mecha-nisms ［J］.Annu Rev Physiol，1995;57（4）:737-769. </p>&l

21、t;p>　　［7］Kilbourn RG，Jubran A，Gross SS.Reversal of endotoxin-me-diated shock by NG-methyl-L-arginine，an inhibitor of nitric ox-ide synthesis ［J］.Biochem Biophys Res Commun，1990;172（3）:1132-1138. </p><p>