黑線倉(cāng)鼠OT-OTR的結(jié)構(gòu)分析與差異表達(dá)研究.pdf

1、黑線倉(cāng)鼠(Cricetulus barabensis)是華北地區(qū)農(nóng)業(yè)害鼠的優(yōu)勢(shì)種,其高繁殖力是影響其種群數(shù)量的主要原因之一,因此研究黑線倉(cāng)鼠的繁殖機(jī)制顯得尤為重要。本文從繁殖相關(guān)基因入手,從分子水平上揭示害鼠種群數(shù)量波動(dòng)機(jī)制,對(duì)鼠害的綜合防控提供新的思路。催產(chǎn)素基因(Oxytocin,OT/Oxt)是與動(dòng)物繁殖行為密切相關(guān)的基因,催產(chǎn)素通過(guò)與催產(chǎn)素受體(Oxytocin Recepter,OTR)的結(jié)合,不僅與分娩、射乳有關(guān),還影響著動(dòng)

2、物的擇偶、攻擊等多種行為。本研究通過(guò)分析黑線倉(cāng)鼠OT及OTR的cDNA序列,預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu),并分別檢測(cè)兩者在不同發(fā)育階段和不同組織器官中的表達(dá)情況,預(yù)測(cè)催產(chǎn)素在黑線倉(cāng)鼠生長(zhǎng)、發(fā)育以及繁殖過(guò)程中所起的作用,從而從分子生物學(xué)角度尋找控制黑線倉(cāng)鼠數(shù)量及其危害性的有效方法。
　　本研究以山東省曲阜市吳村鎮(zhèn)和沂南縣蒲汪鎮(zhèn)的農(nóng)田里捕得的黑線倉(cāng)鼠為研究對(duì)象,用RT-PCR方法分別克隆 OT和OTR的部分 cDNA序列。其中,OT cDNA

3、序列314bp, GenBank登錄號(hào):JQ416144;OTR cDNA序列442bp,GenBank登錄號(hào):JN180665。采用分子生物學(xué)軟件對(duì)兩者的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行分析,并預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果表明:OT編碼區(qū)的C-Y-I-Q-N-C-P-L-G9個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成成熟的OT分子,第一位和第六位的兩個(gè)Cys之間形成一個(gè)二硫鍵,這9個(gè)氨基酸殘基之后的部分則形成 OT的運(yùn)載蛋白,其二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有較多的β轉(zhuǎn)角,同

4、時(shí)應(yīng)用SWISS-MODEL蛋白質(zhì)同源模建服務(wù)器預(yù)測(cè)得到了OT運(yùn)載蛋白的部分三級(jí)結(jié)構(gòu)。OTR的這部分序列包含完整的OTR的7個(gè)跨膜螺旋中的第2、3、4跨膜螺旋和第5跨膜螺旋的一部分,推測(cè)第2跨膜螺旋之前的一個(gè)胞膜外結(jié)構(gòu)域與 OT羧基端的結(jié)合有關(guān),后一個(gè)胞膜外結(jié)構(gòu)域與 OT環(huán)狀結(jié)構(gòu)的識(shí)別有關(guān),第3和4跨膜螺旋結(jié)構(gòu)參與 OT分子識(shí)別的過(guò)程。此外這部分序列中有一個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)和一個(gè)潛在的二硫鍵,4個(gè)連續(xù)的L結(jié)構(gòu)在穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)過(guò)程中起

5、著重要的作用。用SWISS-MODEL蛋白質(zhì)同源模建服務(wù)器預(yù)測(cè)分別得到了其57～87位和1～147位氨基酸的三級(jí)結(jié)構(gòu)。使用DNAMAN分別將黑線倉(cāng)鼠OT和OTR的cDNA序列與大鼠、小鼠、人等幾個(gè)物種的相應(yīng) cDNA序列進(jìn)行同源性對(duì)比分析,發(fā)現(xiàn)黑線倉(cāng)鼠與草原田鼠(Microtus ochrogaster)、金倉(cāng)鼠(Mesocricetus auratus)親緣關(guān)系最近,與大鼠、小鼠較近,與偶蹄目和靈長(zhǎng)目的幾個(gè)物種親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)。

6、　　隨后,本研究還采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法分別比較 OT和OTR在雌雄黑線倉(cāng)鼠亞成年期、成年發(fā)情期以及老年期三個(gè)發(fā)育時(shí)期以及腦、心臟以及生殖器官中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn):OT主要在腦中表達(dá),OTR則主要在外周器官表達(dá),因此認(rèn)為 OT雖然主要在腦中產(chǎn)生,但發(fā)揮生理作用的部位主要在外周器官,這與經(jīng)典的OT神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控機(jī)制相一致。在發(fā)情期,OT在腦和卵巢中表達(dá)均較高,提示了OT對(duì)動(dòng)物發(fā)情行為具有一定影響。在雌性個(gè)體的生殖器官中,尤其是子

7、宮中,OT的表達(dá)量在成年發(fā)情期和老年期遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于亞成年期,間接說(shuō)明在亞成年期子宮發(fā)育尚未完全,結(jié)果提示,測(cè)定蛋白類激素基因表達(dá)量的方法有助于確定雌性黑線倉(cāng)鼠與發(fā)情、生殖有關(guān)的發(fā)育狀態(tài)。另外,發(fā)現(xiàn) OT和OTR在亞成年期個(gè)體心臟中均具有較高的表達(dá)量,推測(cè) OT對(duì)黑線倉(cāng)鼠心臟發(fā)育及其功能發(fā)揮有重要的調(diào)節(jié)作用,其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入的研究。從整體來(lái)看,器官差異產(chǎn)生的OTR表達(dá)量的差別大于發(fā)育時(shí)期不同產(chǎn)生的表達(dá)量的差別,但是對(duì)于 OT,在特