黑線倉鼠KiSS-1啟動(dòng)子區(qū)甲基化的季節(jié)性差異.pdf

1、黑線倉鼠（Cricetulus barabensis）俗稱小腮鼠、背紋倉鼠、花背倉鼠等，是我國北方農(nóng)田害鼠的優(yōu)勢(shì)種，分布范圍廣，繁殖能力強(qiáng)，危害性大。黑線倉鼠的繁殖活動(dòng)具有季節(jié)性節(jié)律，屬于季節(jié)性繁殖動(dòng)物，每年春、秋季為繁殖高峰期，研究黑線倉鼠的季節(jié)性繁殖機(jī)制能夠探究外在環(huán)境信息調(diào)控黑線倉鼠繁殖活動(dòng)的信號(hào)通路，可以探尋從生物學(xué)角度消滅鼠害的方法。KiSS-1/GPR54系統(tǒng)是季節(jié)性繁殖調(diào)控體系中非常重要的一環(huán)，在黑線倉鼠中發(fā)現(xiàn)：KiSS-

2、1的mRNA表達(dá)量和kisspeptin含量都存在季節(jié)性差異，都是冬季的表達(dá)最低，夏秋表達(dá)比較高；而且KiSS-1的mRNA表達(dá)量與光照長(zhǎng)度成正比；褪黑激素對(duì)KiSS-1的表達(dá)具有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)從啟動(dòng)子DNA甲基化入手研究KiSS-1的表達(dá)模式，以探究KiSS-1基因參與黑線倉鼠季節(jié)性繁殖調(diào)控的分子機(jī)制。
　　首先我們利用黑線倉鼠的肝臟組織，通過PCR擴(kuò)增、克隆測(cè)序獲得KiSS-1基因啟動(dòng)子序列，并對(duì)此序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，鑒

3、定其核心啟動(dòng)子并預(yù)測(cè)CpG島為檢測(cè)其甲基化狀態(tài)打下基礎(chǔ)。此序列全長(zhǎng)2012bp，GenBank登錄號(hào)：KU965557，將此序列與黑線倉鼠編碼序列相比對(duì)，找到翻譯起始密碼子，起始密碼子前有序列1997bp，剩余的12bp序列為KiSS-1基因的編碼序列。此序列GC含量為52.3％，高于AT含量。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于起始密碼子上游500bp處，并發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子核心區(qū)TATA框，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-22bp處，并且在TATA框上游發(fā)現(xiàn)順式作用

4、元件CAAT框位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-227bp處。將啟動(dòng)子序列以及附近編碼序列導(dǎo)入MethPrimer預(yù)測(cè)到CpG島，全長(zhǎng)420bp，GC含量為58.6％，遠(yuǎn)高于AT含量，含有11個(gè)CpG位點(diǎn)。
　　選取4個(gè)季節(jié)的雌性黑線倉鼠的下丘腦，我們每個(gè)季節(jié)選取3只雌性黑線倉鼠的下丘腦組織，提取基因組DNA，然后利用亞硫酸鹽測(cè)序法檢測(cè)KiSS-1基因啟動(dòng)子CpG島甲基化狀態(tài)，每個(gè)個(gè)體篩選10個(gè)克隆。利用biq2.0分析測(cè)序結(jié)果做出點(diǎn)狀圖，通

5、過分析點(diǎn)狀圖可以發(fā)現(xiàn)：11個(gè)CpG位點(diǎn)中只有第2個(gè)位點(diǎn)是全部非甲基化狀態(tài)；第5個(gè)CpG位點(diǎn)只有夏季是非甲基化的，其他季節(jié)是甲基化狀態(tài)的。可以推測(cè)第二個(gè)位點(diǎn)與可能KiSS-1基因表達(dá)有關(guān)；夏季KiSS-1基因表達(dá)最高可能與第五個(gè)位點(diǎn)有關(guān)。根據(jù)點(diǎn)狀圖計(jì)算出四個(gè)季節(jié)的黑線倉鼠的甲基化狀態(tài)分別為：81.82％，76.67％，84.85％，89.70％，單因素方差分析發(fā)現(xiàn)冬季的甲基化程度最高，春季和秋季的甲基化程度居中，顯著低于冬季的甲基化程度，

6、而夏季的甲基化程度最低。將其與黑線倉鼠四個(gè)季節(jié)KiSS-1的mRNA表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明黑線倉鼠KiSS-1 mRNA表達(dá)量與KiSS-1啟動(dòng)子甲基化狀況呈中度負(fù)相關(guān)（r=-0.781，p=0.003）。即甲基化程度越高，mRNA表達(dá)量越低，可以推測(cè)啟動(dòng)子甲基化抑制基因表達(dá)。將KiSS-1啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與四個(gè)季節(jié)的光照周期比較，發(fā)現(xiàn)兩者的變化趨勢(shì)相反，即光照時(shí)間越長(zhǎng)，甲基化程度越低，推測(cè)光照長(zhǎng)度與啟動(dòng)子甲基化程度呈負(fù)相關(guān)。而

7、光信號(hào)會(huì)影響褪黑激素的釋放，而褪黑激素也抑制KiSS-1基因的表達(dá)，所以推測(cè)光信號(hào)影響KiSS-1是通過褪黑激素影響KiSS-1啟動(dòng)子甲基化程度來完成的。光照時(shí)間增多會(huì)抑制褪黑激素的分泌，褪黑激素含量降低會(huì)通過一定途徑導(dǎo)致KiSS-1啟動(dòng)子甲基化程度降低，會(huì)使KiSS-1基因的表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)kisspeptin合成，促進(jìn)GPR54表達(dá)，GPR54會(huì)促進(jìn)GnRH神經(jīng)元合成和釋放GnRH，進(jìn)一步促進(jìn)LH和FSH的釋放，促進(jìn)繁殖。