果實(shí)酸性轉(zhuǎn)化酶研究—蘋果果實(shí)酸性轉(zhuǎn)化酶的純化及抗體制備;—脫落酸對(duì)蘋果、葡萄果實(shí)酸性轉(zhuǎn)化酶的調(diào)節(jié).pdf

1、酸性轉(zhuǎn)化酶(β-fructosidase;EC3.2.1.26)包括了定位于液泡的可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶(SAI)和定位于胞外空間的細(xì)胞壁結(jié)合酸性轉(zhuǎn)化酶(CWI),它們?cè)诮?jīng)濟(jì)庫(kù)細(xì)胞中蔗糖的代謝貯藏和作物庫(kù)強(qiáng)調(diào)節(jié)中起著十分關(guān)鍵的作用,因此探討果實(shí)發(fā)育過(guò)程酸性轉(zhuǎn)化酶的調(diào)節(jié)機(jī)制是闡明果實(shí)品質(zhì)形成理論的一個(gè)重要方面.該文首先從蘋果果實(shí)中純化了SAI和CWI,并制備了抗體,在此基礎(chǔ)上,首次探討了促進(jìn)果實(shí)碳水化合物積累的重要激素—脫落酸(ABA)對(duì)蘋果和

2、葡萄果實(shí)酸性轉(zhuǎn)化酶調(diào)節(jié)的酶學(xué)機(jī)制,為進(jìn)一步弄清果實(shí)發(fā)育過(guò)程中酸性轉(zhuǎn)化酶活性調(diào)節(jié)的分子機(jī)制及其生物學(xué)意義奠定了良好的實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ).依次通過(guò)(NH<,4>)<,2>SO<,4>沉淀、離子交換層析、凝膠過(guò)濾和親和層析等步驟從蘋果果實(shí)中分別獲得了電泳純的可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶和細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶蛋白,其亞基分子量約為50kD,全酶分子量均為220kD;這兩種酸性轉(zhuǎn)化酶有著相似的酶學(xué)特性,但它們?cè)谀承┓矫媾c其它植物的酸性轉(zhuǎn)化酶有所不同,如對(duì)棉子糖的Km

3、極高,對(duì)水蘇糖沒有水解活性,果糖對(duì)酶活性的抑制方式為混合型抑制;在蘋果果實(shí)中未發(fā)現(xiàn)有酸性轉(zhuǎn)化酶的蛋白抑制因子.分別將這兩種酸性轉(zhuǎn)化酶的抗血清通過(guò)(NH<,4>)<,2>SO<,4>分級(jí)沉淀、DEAE-Sepharose層析和POD-Sepharose層析純化,根據(jù)Western blotting、免疫抑制分析、酶聯(lián)免疫分析和Protein dot blot,表明所制得的這兩種抗體對(duì)蘋果果實(shí)酸性轉(zhuǎn)化酶有良好的特異性和較高的檢測(cè)靈敏度;利用

4、這些抗體在蘋果的葉、花和果實(shí)的粗提液中均檢測(cè)到三條多肽,分子量分別為50kD、68kD和30kD,后兩條可能在純化過(guò)程中丟失了,蘋果中的這兩種酸性轉(zhuǎn)化酶可能各存在三種亞型.通過(guò)應(yīng)用ABA注射連體的蘋果(Malus Domestica Borkh cv.Starkrimson)果實(shí)和溫育果實(shí)圓片,研究證明:ABA可明顯地激活果實(shí)可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶和細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶,且這種激活作用具有溫育時(shí)間、ABA劑量、介質(zhì)pH、活體組織以及發(fā)育階段的依賴

5、性,ABA最大的激活效應(yīng)在pH5.5介質(zhì)中和盛花后100d的果實(shí);20μmol/LABA溫育40min即可觀察到果實(shí)圓片酸性轉(zhuǎn)化酶活性的增加.酶聯(lián)免疫法定量測(cè)定和Western blotting分析均表明:ABA對(duì)酸性轉(zhuǎn)化酶的這種激活作用不是通過(guò)促進(jìn)酶蛋白的合成來(lái)實(shí)現(xiàn)的,而可能是一種翻譯后的調(diào)節(jié)機(jī)制;根據(jù)這些結(jié)果,我們認(rèn)為以往的研究中所觀測(cè)到的ABA對(duì)經(jīng)濟(jì)庫(kù)器官庫(kù)強(qiáng)的增強(qiáng)效應(yīng)可能與ABA誘導(dǎo)酸性轉(zhuǎn)化酶的激活有關(guān).應(yīng)用外源ABA預(yù)溫育葡萄

6、(V.vinifera.L.×V.lubrusca L.cv.Kyoho)果實(shí)圓片和滲透完整果實(shí)的實(shí)驗(yàn)體系,證實(shí)了ABA在果實(shí)發(fā)育的各個(gè)時(shí)期都促進(jìn)了可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶和細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶活性;并應(yīng)用Western blotting和酶聯(lián)免疫分析,證明了ABA對(duì)酸性轉(zhuǎn)化酶活性的促進(jìn)作用是通過(guò)增加其基因表達(dá)量來(lái)實(shí)現(xiàn)的;ABA的這種激活效應(yīng)具有介質(zhì)pH、溫育時(shí)間、ABA劑量和活體組織的依賴性;蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己亞胺和mRNA轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D