馬鈴薯液泡酸性轉(zhuǎn)化酶基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是世界第四大糧食作物。中國(guó)是馬鈴薯第一生產(chǎn)大國(guó)，馬鈴薯消費(fèi)正由鮮食為主逐漸向高附加值產(chǎn)品轉(zhuǎn)變。為了延長(zhǎng)市場(chǎng)供應(yīng)期，通常將收獲后的馬鈴薯塊莖貯藏在低溫條件下，而低溫貯藏過程中塊莖還原糖含量上升，造成馬鈴薯加工品質(zhì)下降。因此，明確低溫糖化的調(diào)控機(jī)制是馬鈴薯品質(zhì)研究的難點(diǎn)與熱點(diǎn)。前人研究顯示，低溫條件下轉(zhuǎn)化酶活性上升是造成低溫糖化的主要因素。但關(guān)于轉(zhuǎn)化酶基因（StvacINV1）在馬鈴薯塊莖低

2、溫貯藏中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制還不完全明確。
　　 本研究基于本實(shí)驗(yàn)室前期的工作，通過克隆分析StvacINV1基因的啟動(dòng)子，同時(shí)通過分析miRNA及其靶基因，以明確StvacINV1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.StvacINV1基因在抗低溫糖化和低溫糖化敏感型基因型中的表達(dá)模式
　　 研究選用6個(gè)馬鈴薯基因型作為材料，分析不同基因型的低溫糖化敏感程度和StvacINV1表達(dá)模式。結(jié)果顯示，

3、20℃條件下所有基因型在整個(gè)貯藏期間的炸片色澤、還原糖含量和蔗糖含量變化幅度較小，但在4℃條件下貯藏的塊莖，所有基因型炸片色澤隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸加深，還原糖含量和蔗糖含量上升。色澤指數(shù)分析顯示，抗低溫糖化基因型ND860-2、10908-06、CW2-1薯片色澤指數(shù)上升幅度較小;而低溫糖化敏感基因型11059-01、ED25和E3薯片色澤指數(shù)上升幅度較大。可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶活性和StvacINV1轉(zhuǎn)錄本豐度分析顯示，可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶活

4、性在4℃貯藏5d-15d之間上升，而StvacINV1轉(zhuǎn)錄本豐度則在4℃貯藏8h-16h即開始上升。低溫貯藏后，StvacINV1轉(zhuǎn)錄本豐度均高于20℃貯藏的水平，且在栽培種中抗低溫糖化基因型和低溫糖化敏感基因型間StvacINV1基因的表達(dá)模式無規(guī)律性的差異。但野生種S.berthaultii(CW2-1)的StvacINV1基因表達(dá)水平在低溫貯藏5d時(shí)明顯低于栽培種，暗示該基因型中StvacINV1基因在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控可能影響其低溫

5、糖化性狀。
　　 2.StvacINV1基因啟動(dòng)子克隆與功能分析
　　 為了明確StvacINV1基因在不同基因型中的表達(dá)是否與啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)有關(guān)，實(shí)驗(yàn)選用10個(gè)馬鈴薯基因型，采用高效熱不對(duì)稱PCR技術(shù)克隆了StvacINV1基因的啟動(dòng)子。測(cè)序結(jié)果顯示，來自馬鈴薯不同基因型的啟動(dòng)子序列一致性為94.1％-99.9％，其結(jié)構(gòu)上沒有規(guī)律性的差異。生物信息學(xué)分析顯示，StvacINV1基因啟動(dòng)子序列上有9個(gè)糖抑制元件、8個(gè)赤霉素應(yīng)

6、答元件。進(jìn)一步轉(zhuǎn)基因分析表明，該啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因在根、莖、葉以及塊莖中表達(dá)，蔗糖、葡萄糖、果糖抑制啟動(dòng)子活性，而赤霉素和生長(zhǎng)素可促進(jìn)啟動(dòng)子活性。啟動(dòng)子缺失實(shí)驗(yàn)證明，該啟動(dòng)子應(yīng)答蔗糖/葡萄糖、赤霉素、生長(zhǎng)素的啟動(dòng)子區(qū)域分別為-118至-551、-551至-1021，以及-1021至-1521。在本研究中，低溫能夠抑制StvacINV1基因啟動(dòng)子活性，與該基因的表達(dá)模式存在明顯的差異，暗示該基因的表達(dá)水平可能受到其它因素的影響，如轉(zhuǎn)錄后

7、調(diào)節(jié)。
　　 3.低溫糖化相關(guān)的miRNA及其靶基因分析
　　 研究以抗低溫糖化基因型10908-06為材料，分別構(gòu)建了塊莖4℃和20℃貯藏條件下的small RNA文庫和降解組文庫。通過高通量測(cè)序和分析，共獲得53個(gè)knownmiRNA、60個(gè)novel miRNA、70個(gè)miRNA*以及70個(gè)靶基因。以測(cè)序信息為基礎(chǔ)的分析結(jié)果表明，36個(gè)miRNA/miRNA*在不同貯藏溫度條件下呈現(xiàn)差異表達(dá)。進(jìn)一步選擇了24個(gè)mi

8、RNA/miRNA*和55個(gè)靶基因通過RT-qPCR進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果顯示，共有12 miRNA/miRNA*和11個(gè)靶基因在4℃和20℃以及抗低溫糖化和低溫糖化敏感型基因型間表達(dá)水平差異顯著。
　　 12個(gè)表達(dá)差異顯著的miRNA/miRNA*與已進(jìn)行RT-qPCR分析的靶基因比較分析，有6個(gè)miRNA/miRNA*可以匹配上11個(gè)靶基因。這11個(gè)靶基因中，有3個(gè)靶基因在在兩個(gè)溫度及兩個(gè)基因型間的表達(dá)差異達(dá)到顯著水平，3個(gè)靶基

9、因涉及1個(gè)miRNA(miR172)和1個(gè)miRNA*(miR396a-3p)。miRNA/miRNA*及其靶基因的對(duì)比分析證明，miR172在抗低溫糖化基因型中，塊莖低溫貯藏2d顯著上調(diào)表達(dá)，其匹配的靶基因在同一處理的時(shí)間內(nèi)下調(diào)表達(dá)，靶基因呈現(xiàn)明顯的miRNA調(diào)控關(guān)系。miR396a-3p與其靶基因未呈現(xiàn)明顯的調(diào)控表達(dá)模式。
　　 在本研究中，miRNA/miRNA*未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化酶靶基因，同時(shí)，StvacINV1的轉(zhuǎn)錄本水平與馬