酶解斑點(diǎn)叉尾鮰內(nèi)臟制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽及純化工藝研究.pdf

1、斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punctatus)是我國成功引進(jìn)的淡水魚之一,近年來其養(yǎng)殖量逐年遞增。內(nèi)臟是水產(chǎn)加工業(yè)的副產(chǎn)物之一,其蛋白含量為11.90％,是較為良好的蛋白質(zhì)源,對其進(jìn)行深加工,不但可以增加其附加值,還能起到環(huán)境保護(hù)作用。本論文研究了酶解斑點(diǎn)叉尾鮰內(nèi)臟蛋白制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽工藝、酶解液的純化工藝以及分子量小于1000Da組分的功能特性。
　　 1)斑點(diǎn)叉尾鮰內(nèi)臟經(jīng)過脫脂后,得到脂肪含量較低的蛋白。通過

2、篩選得出木瓜蛋白酶為酶解魚內(nèi)臟蛋白制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的最適酶,并研究該酶的酶解條件對酶解產(chǎn)物ACE抑制活性的影響。以酶解產(chǎn)物ACE抑制率為指標(biāo),通過響應(yīng)面優(yōu)化得出酶解產(chǎn)物ACE抑制率(Y)與酶解溫度(A)、初始pH值(B)以及液料比(C)之間的二次方程為:
　　 Y(％)=70.74+1.23A+0.98B+0.84C-0.28AB+0.072AC-0.095BC-10.69A2-16.02B2-1.61C2通過軟件

3、分析得到最佳酶解工藝條件為:酶解溫度為55.29℃、pH值為7.51、液料比為2.26,在此水解條件下得到產(chǎn)物的ACE抑制率預(yù)期值為70.90％。酶解產(chǎn)物ACE抑制活性與水解度沒有明顯的線性關(guān)系。酶解產(chǎn)物氨基酸含量高,其中疏水性氨基酸的含量為39.13g／100g蛋白質(zhì)。
　　 2)在響應(yīng)面優(yōu)化得出的最優(yōu)酶解方案下制備酶解液,使用截留分子量分別為1000Da和3000Da的超濾膜對酶解液進(jìn)行分離純化。酶解液經(jīng)過超濾被分成3個(gè)組分

4、,分子量小于1000Da組分具有較高的ACE抑制活性,其IC50值為1.052mg／mL。通過超濾分子量小于1000Da組分的IC50值由原水解液的1.596 mg／mL降低為1.052 mg／mL。使用葡聚糖凝膠樹脂對分子量小于1000Da,組分進(jìn)行進(jìn)一步純化,實(shí)驗(yàn)得出蒸餾水是合適的洗脫劑。分子量小于1000Da組分經(jīng)過Sephadex G-25過濾得到4個(gè)組分,其中組分F2具有較高的ACE抑制活性,其IC50值為1.032mg／mL

5、。使用Sephadex G-15對組分F2進(jìn)一步純化,得到2個(gè)主要組分,其中組分F21具有較高的ACE抑制活性,其IC50值為0.867mg／mL。使用RP-HPLC對組分F21進(jìn)一步純化,得到的組分H2具有較高的ACE抑制活性,其IC50值為27.46μg／mL。通過質(zhì)譜分析得出組分H2的分子量為385.67Da,通過估算可知,組分H2為一個(gè)由3到4個(gè)氨基酸組成的短肽。
　　 3)對分子量小于1000Da組分進(jìn)行功能性質(zhì)研究。

6、分子量小于1000Da組分在pH值2.0-10.0范圍內(nèi),其溶解度維持在95％左右。分子量小于1000Da組分在中性條件下在較高溫度較長時(shí)間加熱過程中能夠保持良好的ACE抑制活性,當(dāng)加熱溫度在80℃及以下時(shí),分子量小于1000Da組分加熱時(shí)間在60min以內(nèi),其對ACE的抑制活性能夠維持在63％；分子量小于1000Da組分在90℃加熱60min,其對ACE的抑制活性能夠維持在60％左右。在實(shí)驗(yàn)室溫度條件下,分子量小于1000Da組分在p