家蠶一未知基因的研究.pdf

1、在對家蠶蛹cDNA文庫測序分析中，發(fā)現(xiàn)一個編碼家蠶未知功能蛋白的cDNA序列，并將其命名為BmWZ。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，該cDNA序列全長為50.bp，含有一個長25.bp的開放閱讀框(ORF)，其編碼的蛋白質(zhì)為未知，全長84個氨基酸殘基，預測其相對分子質(zhì)量為9 kD，等電點為4.54。PCR擴增其ORF，回收產(chǎn)物經(jīng)Bam.I和Hin.III雙酶切后，克隆到融合表達載體pET-28a(+)相應的酶切位點上，得到重組質(zhì)粒pET-28a(+

2、)-BmWZ。經(jīng)PCR、雙酶切鑒定以及測序證明重組正確。將構建的重組質(zhì)粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)菌株感受態(tài)細胞，用終濃度為0 mM的IPTG誘導重組菌后，超聲裂解菌體作SDS-PAGE分析，在13 kD左右的位置有一條特異性蛋白條帶，與預期值(融合標簽為3 kD，BmW.9 kD)相符，融合蛋白以包涵體形式存在。大量表達時用超聲裂解菌體分離并純化包涵體：對包涵體進行溶解和梯度透析復性；采用親和層析純化His-BmWZ融合蛋白。以純