家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究及應(yīng)用.pdf

1、家蠶是支撐蠶絲產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)昆蟲,也是鱗翅目昆蟲中的典型模式生物。對家蠶基因組及其重要功能基因的研究,將對蠶絲業(yè)和農(nóng)林害蟲的防治和生物制藥產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。當(dāng)前,轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為研究重要功能基因、開發(fā)生物反應(yīng)器、創(chuàng)造新素材新品種、進(jìn)行生物防治的理想途徑和有效方法。然而,與其它模式生物相比,家蠶的轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系尚處于構(gòu)建和成熟的階段,特別在我國。基本上處于摸索階段。本研究以高效穩(wěn)定的家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系的構(gòu)建及其應(yīng)用探索為重點(diǎn),主要進(jìn)行了以下

2、5個方面的研究:
　　 1建立了高效穩(wěn)定的家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系獲得轉(zhuǎn)基因動物,基因?qū)胧顷P(guān)鍵。在本研究中,我們利用兩個具有不同啟動子的piggyBac來源的載體pPIGA3GFP和pBac[3×P3-EGFPaf],對蠶卵進(jìn)行了顯微注射,并對蠶卵注射時間、注射DNA量等條件進(jìn)行了探索,發(fā)現(xiàn)在蠶卵產(chǎn)下2小時左右注射,以水溶解DNA,注射量大約為10nl時獲得轉(zhuǎn)基因蠶的效率比較高。在注射A3GFP載體的61個G1蛾區(qū)中,9個蛾區(qū)檢測到

3、有熒光蠶的表達(dá),G1代蛾區(qū)陽性率達(dá)到14.7％。遺傳分析表明GFP熒光可以遺傳,并且遵循孟德爾遺傳規(guī)律,至今經(jīng)過10多代飼養(yǎng),轉(zhuǎn)基因系GFP仍然穩(wěn)定表達(dá)。對轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行Southernbloting分析表明,GFP基因以1-3個拷貝插入家蠶染色體上,通過iPCR對轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)兩側(cè)的序列分析,所有插入位點(diǎn)兩側(cè)都有TTAA特征性序列,表明轉(zhuǎn)基因是由轉(zhuǎn)座作用所引起。
　　 2家蠶GALA/UAS系統(tǒng)的建立利用酵母GAL4/UAS系統(tǒng)

4、可精確控制目的基因的表達(dá)時間和場所等的特性,結(jié)合以piggyBac為載體的轉(zhuǎn)基因蠶技術(shù)和家蠶RNAi技術(shù),能夠?qū)崿F(xiàn)特定基因功能的喪失或特定基因功能的獲得,從而使家蠶重要功能基因功能的研究和利用成為可能。本研究基于此目的,構(gòu)建了GAL4和UAS轉(zhuǎn)基因載體,注射蠶卵后,獲得了GAL4轉(zhuǎn)基因系和UAS轉(zhuǎn)基因系。在UAS轉(zhuǎn)基因系中,以家蠶Magonashi基因為靶基因,將GAL4轉(zhuǎn)基因系和UAS轉(zhuǎn)基因系雜交后,發(fā)現(xiàn)后代中Magonashi基因表

5、達(dá)顯著提高,表明我們成功利用GAL4/UAS系統(tǒng)實現(xiàn)了在家蠶中靶基因的過量表達(dá),為今后家蠶功能基因組的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 3在家蠶后部絲腺特異表達(dá)植酸酶融合蛋白在成功建立了轉(zhuǎn)基因家蠶技術(shù)體系的基礎(chǔ)上,本研究利用來源于一株黑曲霉的植酸酶基因,構(gòu)建了植酸酶融合表達(dá)載體pBac[3×P3-EGFP+FibL-phyA-DsRed]。該融合蛋白包含輕鏈絲素部分cDNA、植酸酶基因以及DsRed基因。在輕鏈絲素啟動子序列的作用下,可調(diào)

6、控這種融合蛋白在絲腺內(nèi)特異表達(dá),形成含有植酸酶蛋白和紅色熒光蛋白的蠶絲。
　　 我們將該載體注射了大約700粒蠶卵,在53個G1蛾區(qū)中,得糾3個轉(zhuǎn)基因陽性蛾區(qū),其中的轉(zhuǎn)基因陽性個體在5齡蠶絲腺及繭殼都可檢測到紅色熒光表達(dá)。Sounthernblot和反向PCR結(jié)果也證明轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒整合到家蠶染色體上。將轉(zhuǎn)基因蠶的繭殼用飽和LiSCN溶解后,經(jīng)Westernblot分析,檢測到約107kDa的條帶,與預(yù)期的融合蛋白大小相符,表明我

7、們成功得到表達(dá)植酸酶基因的轉(zhuǎn)基因家蠶。家蠶絲腺具有巨大的蛋白質(zhì)合成能力,是一種具有很大開發(fā)潛力的生物反應(yīng)器,本實驗在這方面進(jìn)行了初步探索,為進(jìn)一步開發(fā)家蠶生物反應(yīng)器,無疑具有積極的促進(jìn)作用。
　　 4在中部絲腺特異表達(dá)人胰島素樣生長因子1基因(hIGF-1)本研究將hIGF-1基因的全長CDS序列及成熟肽編碼序列與家蠶絲膠基因1上游調(diào)控序列構(gòu)建成兩個轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體,注射蠶卵后,分別獲得40個和68個G1蛾區(qū)。經(jīng)過對胚胎中后期的熒

8、光檢測,分別獲得2個和4個轉(zhuǎn)基因陽性蛾區(qū)。經(jīng)RT-PCR分析,hIGF-1基因特異性地在轉(zhuǎn)基因蠶中部絲腺表達(dá)；Elisa檢測結(jié)果表明,在1ml絲膠蛋白質(zhì)(1.6mg)中可檢測到約510-890ng的IGF-1蛋白；Westernblot結(jié)果顯示絲腺表達(dá)的hIGF-1為7.5kd的成熟hIGF-1。對絲腺表達(dá)的IGF-1進(jìn)行生物學(xué)活性檢測,發(fā)現(xiàn)添加rhIGF-1可促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞的生長,具有良好的生物學(xué)活性。
　　 5利用轉(zhuǎn)基

9、因RNAi技術(shù)提高家蠶對BmNPV的抗性的探索本研究選擇了BmNPV的DNA聚合酶、ProteinKinase(PK1)、bro-d、orf1629基因的部分編碼片段,以反向重復(fù)的形式與BmActin3啟動子構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體,通過顯微注射蠶卵,獲得了36-107個G1蛾區(qū),得到了20-123頭轉(zhuǎn)基因陽性蠶。經(jīng)過RT-PCR及Southern雜交分析表明,4個BmNPV的片段都已經(jīng)導(dǎo)入家蠶基因組中,并進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄。從攻毒實驗看出,只有B

10、mNPV的DNA聚合酶和ProteinKinase(PK1)的反向重復(fù)片段有干涉作用,從而使家蠶對BmNPV具有一定的抗性；而BmNPV的bro-d和orf1629基因反向重復(fù)片段幾乎沒有干涉作用?？赡苁怯捎贐mNPV的DNA聚合酶和PK1基因是病毒DNA復(fù)制及表達(dá)所必需的基因,它們都屬于早期表達(dá)的基因,在轉(zhuǎn)基因系中被抑制后。就抑制了BmNPV的增殖。而bro-d基因雖然是BmNPV的必需基因,但不是最早期表達(dá)基因,當(dāng)病毒DNA大量復(fù)制