廣西豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離及E基因的原核表達(dá).pdf

1、本課題旨在從廣西本地豬場分離毒株，通過與已發(fā)表毒株的對比核苷酸和氨基酸序列，了解廣西PRRS的流行特點(diǎn)。并且以本地分離株為基礎(chǔ)，克隆表達(dá)其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的E基因，構(gòu)建成熟的原核表達(dá)系統(tǒng)，為今后基因工程疫苗的生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)從廣西以及鄰近省市收集大量疑似病料，進(jìn)行RT-PCR的檢測，獲得陽性材料后；使用肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)和非洲綠猴腎細(xì)胞的衍生細(xì)胞系MARC-145細(xì)胞進(jìn)行病毒的分離；對其E基因進(jìn)行克隆測序，并與發(fā)表毒株進(jìn)行比

2、較；隨后，構(gòu)建E基因的原核表達(dá)系統(tǒng)，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)期間，共收集了79份疑似病料，全部進(jìn)行RT-PCR檢測，累計(jì)獲得42份陽性病料。將所有陽性病料處理后，接種PAM和MARC-1 45兩種細(xì)胞，分離到GD株。對其E基因克隆測序后，通過與已發(fā)表毒株的比較，發(fā)現(xiàn)GD株與美洲株的親緣關(guān)系較近，而與歐洲株關(guān)系較遠(yuǎn)。設(shè)計(jì)了另外一對特異性引物對其E基因進(jìn)行擴(kuò)增，并亞克隆進(jìn)PET-30a，PET-32a載體，經(jīng)過酶切鑒定，證明成功構(gòu)建E基因的重組