混合霉菌毒素對小鼠肝腎氧化應激及卵母細胞質量影響.pdf

1、霉菌毒素是真菌或霉菌代謝產生的次級代謝產物[1]。在植物、糧食（包括玉米、小麥、大麥等谷物）和土壤中均可檢出霉菌毒素。霉菌毒素對人和動物具有毒性作用，不僅可以降低食品和飼料營養(yǎng)成分，還造成人和畜禽機體損傷。霉菌毒素對人和動物機體的危害主要表現(xiàn)在抑制營養(yǎng)吸收、導致氧化應激反應、誘發(fā)生殖障礙（例如對卵母細胞質量的破壞）等。嚴重威脅畜禽健康的霉菌毒素是采食量較大的飼料原料中存在的霉菌毒素，包括黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、煙曲霉毒素B1和煙曲

2、霉毒素B2、嘔吐毒素、T-2毒素、玉米赤霉烯酮、麥角堿、麥角堿衍生物和大環(huán)類單端孢霉烯。長期以來圍繞霉菌毒素的研究較多，但針對混合霉菌毒素的研究很少，尤其關于混合霉菌毒素的生殖毒性研究更少。伴隨全球貿易活動頻繁，糧食運輸和貯藏過程中霉菌污染可能性增加;玉米酒精技術的飛速發(fā)展，玉米酒糟可溶物(DDGS)產量驟增，DDGS對霉菌毒素的富集作用，造成飼料行業(yè)遭受霉菌毒素污染情況更加嚴重，因此關于霉菌毒素危害研究再次成為研究工作熱點與難點。本論

3、文重點研究攝食混合霉菌毒素污染飼料對小鼠肝腎毒性作用及卵母細胞質量破壞作用，進一步使用玉米赤霉烯酮(ZEN)處理卵泡顆粒細胞和卵母細胞，綜合評價混合霉菌毒素對小鼠毒性作用及ZEN純品的生殖毒性作用。
　　一.混合霉菌毒素導致青春期雌鼠機體氧化應激反應
　　試驗選用自然霉變玉米配制小鼠飼料，霉變玉米添加比例依次為0％，15％，30％。選用90只3周齡清潔級ICR小白鼠，隨機分成3組，每組30只，分別飼喂含有不同比例霉變玉米的日

4、糧。飼喂4周結束時，取血液、腎臟和肝臟樣品進行氧化應激相關指標測定，RT-PCR法定量分析抗氧化酶相關基因mRNA表達量。結果表明:與對照組相比，高濃度組（30％霉變玉米）的小鼠的體重顯著降低。經(jīng)過四周飼喂霉菌毒素造成小鼠肝臟、腎臟和脾臟不同程度組織出血，腫大和變硬壞死現(xiàn)象。其中，低濃度組和高濃度組肝臟指數(shù)分別為4.67±0.50％和5.00±0.30％，而對照組為4.14±0.35％。低濃度組和高濃度組腎臟指數(shù)分別為1.33±0.11

5、％和1.42±0.12％，對照組為1.12±0.08％。低濃度組和高濃度組脾臟指數(shù)分別為0.40±0.11％和0.55±0.11％，對照組為0.25±0.03％。組織病理學結果顯示霉菌毒素處理組的肝臟和腎臟均出現(xiàn)組織壞死病灶;肝細胞形態(tài)改變，細胞核濃縮，肝索紊亂，血管內壁有凋亡細胞且血管形態(tài)改變，有凋亡、炎癥細胞浸潤和集落可見;腎小球與腎小囊間隙被凋亡細胞充斥，腎小球內有血細胞殘留，凋亡細胞量增加，腎臟組織內充滿炎癥細胞集落。通過比較試

6、驗前和試驗后血清中GPT和GOT活性變化，發(fā)現(xiàn)處理組血清中GPT活性升高。血清、肝臟、腎臟內MDA水平升高。肝臟和腎臟組織內SOD和CAT酶活性變化及其基因mRNA表達量降低。
　　二.混合霉菌毒素對青春期雌鼠卵巢形態(tài)及卵母細胞質量的影響
　　選用120只3周齡清潔級ICR小白鼠，隨機分為3組，飼喂日糧同試驗一。通過統(tǒng)計卵巢指數(shù)，組織切片HE染色觀察卵巢內卵泡形態(tài)變化，體外成熟卵母細胞方法和免疫熒光染色技術，研究混合霉菌毒素

7、對小鼠卵巢形態(tài)及卵母細胞質量影響。結果表明:小鼠攝食混合霉菌毒素污染飼料4周后，卵泡變小且卵泡內卵泡液不飽滿，處理組卵巢指數(shù)(0.05±0.01％)較對照組降低(0.06±0.01％)。處理組小鼠卵巢內卵泡數(shù)量變少，且卵泡內顆粒細胞凋亡脫落現(xiàn)象明顯。處理組卵巢內卵母細胞數(shù)量較對照組下降，統(tǒng)計正常GV期卵母細胞比例發(fā)現(xiàn)，低濃度和高濃度處理組GV期卵母細胞比例由73.22±3.51％（對照組）分別降至64.35±2.62％和58.97±5.

8、52％。高濃度處理組GVBD率較對照組和低濃度組顯著降低，混合霉菌毒素處理組的第一極體排出率均較對照組降低，高濃度組第一極體排出率（46.59±7.38％）顯著低于對照組(77.58±5.21％)(p＜0.05)。處理組小鼠卵母細胞成熟、發(fā)育能力下降，受精后發(fā)育能力較對照組遲緩。通過微絲肌動蛋白熒光定位和熒光強度對比發(fā)現(xiàn)差異顯著(p＜0.05)。處理組小鼠卵母細胞成熟過程中微絲肌動蛋白熒光強度較對照組降低，微絲帽形成比例降低，細胞膜和細

9、胞質內微絲肌動蛋白熒光強度均較對照組降低。profilin-1和mDia1蛋白表達在處理組中功能區(qū)表達不明顯。對照組皮質顆粒(CG)在卵母細胞細胞膜下致密分布，在DNA區(qū)形成皮質顆粒空白區(qū)(CGFD)。處理組卵母細胞CG分布致密度較對照組差，大部分未形成CGFD。處理組小鼠卵母細胞紡錘體構型破壞嚴重，處理組紡錘體異常率顯著升高(p＜0.05)。處理組γ-tubulin的分布發(fā)生變化，熒光染色定位顯示彌散或不能集中定位，這與α-tubul

10、in構型異常結果相吻合。對照組多數(shù)卵母細胞線粒體分布為核周聚集和均質分布兩種狀態(tài)，而處理組凝聚分布的比例較對照組顯著升高(p＜0.05)。
　　三.ZEN導致小鼠卵巢顆粒細胞損傷及卵母細胞質量下降
　　使用不同濃度ZEN處理小鼠卵泡顆粒細胞和卵母細胞，測定卵泡顆粒細胞增殖活性，利用免疫熒光染色方法觀察卵母細胞微絲和微管相關蛋白定位及相對表達量。結果發(fā)現(xiàn)，卵泡顆粒細胞增殖活性及凋亡相關基因表達與培養(yǎng)基中ZEN濃度呈劑量相關關系

11、，隨ZEN濃度升高顆粒細胞增殖活力降低，凋亡相關基因表達上升。ZEN處理小鼠卵母細胞，導致卵母細胞生發(fā)泡破裂困難，微絲和皮質顆粒在細胞質內遷移困難，紡錘體構型異常率升高。
　　本論文研究了混合霉菌毒素對小鼠肝腎氧化應及卵母細胞質量影響，系統(tǒng)地探明混合霉菌毒素對小鼠的毒性作用;進一步為了探明每種霉菌毒素的生殖毒性效應，首先選用ZEN于體外處理小鼠卵巢主要功能細胞，探明ZEN對顆粒細胞和卵母細胞的毒性作用。本論文研究工作使用自然條件下