ABA誘導(dǎo)的水稻葉片中OsHsfs基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、植物激素脫落酸（abscisic acid，ABA）可以參與調(diào)節(jié)植物抗逆境（包括干旱、冷害、鹽害等）的多種生理反應(yīng)。近年來，植物激素ABA作為重要信號分子的研究越來越深入廣泛.已有研究表明ABA的作用模式與植物細(xì)胞中氧化脅迫有關(guān)，ABA能夠誘導(dǎo)NADPH氧化酶引起活性氧產(chǎn)生及抗氧化基因的表達(dá)，從而提高植物抗氧化防護(hù)能力。植物熱激轉(zhuǎn)錄因子（heat shock transcription factors，Hsfs）作為植物熱激反應(yīng)時(shí)的主要

2、調(diào)控因子，在植物熱激脅迫下的研究已經(jīng)非常豐富深入.除了熱激反應(yīng)外，熱激轉(zhuǎn)錄因子還參與了植物其他非生物脅迫如干旱和氧化等脅迫的反應(yīng)過程，并通過調(diào)節(jié)脅迫基因的表達(dá)而提高植物氧化脅迫耐性.但是關(guān)于ABA誘導(dǎo)的氧化脅迫信號途徑與植物熱激轉(zhuǎn)錄因子Hsfs基因關(guān)系方面的研究尚未見報(bào)道.為此，本實(shí)驗(yàn)以水稻為研究對象，利用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，以半定量RT-PCR為主要研究手段對水稻中兩條OsHsfs基因OsHsfA4a和OsHsfA2與

3、ABA和H2O2的關(guān)系進(jìn)行了研究.主要結(jié)果如下：
　　 采用半定量RT-PCR方法，100μmol·L-1 ABA處理后，水稻OsHsfA4a和OsHsfA2基因的轉(zhuǎn)錄水平和對照相比，分別在4h處理時(shí)間內(nèi)的30min和180min產(chǎn)生兩個(gè)上調(diào)表達(dá)高峰；10 m mol·L-1 H2O2處理后，水稻OsHsfA4a和OsHsfA2基因的轉(zhuǎn)錄水平和對照相比，分別在4 h處理時(shí)間內(nèi)的15 min和120 rain產(chǎn)生兩個(gè)上調(diào)表達(dá)高峰；

4、H2O2清除劑DMTU、CAT和抑制劑DPI預(yù)處理后的樣品較對照樣品，所有時(shí)間點(diǎn)OsHsfs基因表達(dá)情況和對照近乎相同，說明預(yù)處理后的ABA處理沒有誘導(dǎo)水稻OsHsfs基因表達(dá)增強(qiáng)。H2O2清除劑預(yù)處理后ABA誘導(dǎo)產(chǎn)生的H2O2被有效清除了，ABA不能誘導(dǎo)水稻OsHsfs基因表達(dá)增強(qiáng).證明了ABA誘導(dǎo)水稻OsHsfs基因表達(dá)增強(qiáng)是通過ABA誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源H2O2來起作用的.這些結(jié)果初步闡明了在ABA信號途徑中ABA、H2O2與植物熱激轉(zhuǎn)

5、錄因子三者之間的關(guān)系，從而為ABA誘導(dǎo)植物細(xì)胞抗氧化防護(hù)系統(tǒng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供了新的證據(jù).
　　 原生質(zhì)體瞬間表達(dá)系統(tǒng)以游離分散的植物細(xì)胞和原生質(zhì)體為研究對象，借助物理或化學(xué)方法將外源DNA直接導(dǎo)入植物細(xì)胞，使DNA進(jìn)入植物細(xì)胞核，并在短期內(nèi)能夠檢測到基因表達(dá)產(chǎn)物-新蛋白質(zhì)的合成和酶的活性.至今原生質(zhì)體瞬間表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于諸如不同的調(diào)控順序和基因功能，植物激素、紫外光、熱激、厭氧條件、代謝產(chǎn)物等各種內(nèi)外因素對基因表達(dá)影響的

6、研究。本實(shí)驗(yàn)通過分子生物學(xué)方法克隆了兩條受ABA誘導(dǎo)的OsHsfA4a基因OsHsfA4a和OsHsfA2的全長ORF序列，進(jìn)一步成功構(gòu)建了含有目的基因和以黃色熒光蛋白（yellow fluorescent proteins，YFP）為報(bào)告基因的重組原生質(zhì)體瞬間表達(dá)載體，為以后水稻原生質(zhì)體瞬間表達(dá)體系轉(zhuǎn)化等工作做準(zhǔn)備，為進(jìn)一步研究ABA誘導(dǎo)的OsHsfs在水稻原生質(zhì)體瞬間表達(dá)體系中的亞細(xì)胞定位以及ABA誘導(dǎo)的OsHsfs基因表達(dá)與ABA