柑橘低溫誘導(dǎo)相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、柑橘原產(chǎn)我國(guó)，目前我國(guó)是第二大柑橘生產(chǎn)國(guó)。凍害是世界性的柑橘生產(chǎn)上的主要災(zāi)害之一。歷史上，我國(guó)長(zhǎng)江流域、美國(guó)佛羅里達(dá)州和加里佛利亞州等柑橘產(chǎn)區(qū)就因嚴(yán)重的周期性凍害數(shù)次遭受嚴(yán)重打擊。抗寒育種成為世界各柑橘生產(chǎn)國(guó)柑橘育種的主要內(nèi)容之一。人們通過(guò)各種傳統(tǒng)的育種手段去改善柑橘的抗寒性，由于柑橘的抗寒性是多基因控制的數(shù)量性狀，抗寒力強(qiáng)的通常為野生類型，其雜種后代果實(shí)味苦不能食用，再加上多胚性的干擾，使得柑橘的抗寒雜交育種一直未取得重大突破?；蚬?/p>

2、程技術(shù)給柑橘抗育種帶來(lái)了希望。在中國(guó)，枳(Poncirus trifoliata(L.)Raf.)是商業(yè)栽培柑橘品種的一種主要砧木，因?yàn)殍鬃髡枘究商岣呒藿悠贩N的抗寒能力及對(duì)某些病蟲的抗性。因而，與不太抗寒的柑橘相比，枳很有可能擁有并表達(dá)特別的低溫響應(yīng)基因或蛋白質(zhì)以增強(qiáng)其抗寒性，然而對(duì)這類基因或蛋白質(zhì)知之甚少。本研究采用抑制性差減雜交技術(shù)和蛋白質(zhì)組技術(shù)，以柑橘枳為主要材料，從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平分離柑橘低溫誘導(dǎo)差異表達(dá)的相關(guān)基因，為實(shí)施柑橘

3、抗寒基因工程培育抗寒品種奠定基礎(chǔ)，為探明柑橘抗寒的分子機(jī)理提供理論依據(jù)。取得研究結(jié)果如下： 摸索出2年生枳苗和宮本苗在生長(zhǎng)期秋季耐受低溫的臨界處理分別為-6℃處理60min和-6℃處理40min，為后續(xù)試驗(yàn)的材料處理奠定了基礎(chǔ)。 完善了抑制性差減雜交試劑盒(PCR-Select<'TM> cDNA Subtraction Kit)在柑橘植物上的應(yīng)用，用看家基因ACTIN基因(上游引物5’-CACACTGGAGTGATGG

4、TTGG-3’，下游引物5’-ATTGGCCTTGGGGTTAAGAG-3’)檢測(cè)接頭連接效率和差減雜交效率，接頭連接時(shí)間延長(zhǎng)至20 h。 從柑橘枳葉片中克隆到1個(gè)長(zhǎng)849bp的冷誘導(dǎo)基因Ptcor8，生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，Ptcor8屬于植物WCOR413冷誘導(dǎo)蛋白家族的一個(gè)cDNA全長(zhǎng)，具有一個(gè)621bp的潛在編碼區(qū)，編碼206個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，Ptcor8編碼的蛋白質(zhì)分子量為22.8kD，pI9.4

5、，具有5個(gè)疏水區(qū)，5個(gè)跨膜螺旋，6個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，亞細(xì)胞定位和分子系統(tǒng)發(fā)育分析均表明該蛋白為質(zhì)膜型冷誘導(dǎo)蛋白。Ptcor8基因已提交GenBank，接受號(hào)為EU077497。對(duì)Ptcor8基因進(jìn)行了初步的表達(dá)分析，該基因在26℃時(shí)不表達(dá)，在17℃～-6℃時(shí)表達(dá)，持續(xù)表達(dá)時(shí)間不短于1d，與枳低溫誘導(dǎo)的抗寒鍛煉關(guān)系密切。 用雙向電泳技術(shù)獲得枳和宮本低溫誘導(dǎo)的差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜，在質(zhì)譜分析的22個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)中， 4個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的

6、鑒定結(jié)果可信度較高。選擇可信度較高的枳2號(hào)蛋白質(zhì)點(diǎn)鑒定結(jié)果抗性蛋白(resistance protein)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以枳基因組DNA為模板擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化、克隆測(cè)序，得到1個(gè)長(zhǎng)676bp的抗性蛋白編碼基因Ptcorp，BLAST同源搜索結(jié)果顯示，Ptcorp與越橘藍(lán)豐低溫鍛煉表達(dá)文庫(kù)中的一個(gè)EST具有88％的同源性，預(yù)示Ptcorp與低溫鍛煉有關(guān)。半定量RT-PCR表達(dá)分析結(jié)果顯示，低溫脅迫時(shí)Ptcorp明顯上調(diào)表達(dá)，與蛋白質(zhì)