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文檔簡介
1、CBF是被低溫誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,它含有與DNA結(jié)合的AP2結(jié)合域,通過與低溫誘導(dǎo)基因啟動子區(qū)域的CRT/DRE(C-repeat/DehydrationResponsiveElement)調(diào)控元件結(jié)合,誘導(dǎo)抗寒基因COR(cold-regulated)的表達(dá),從而提高植物的抗寒性。另外CBF基因在抗旱抗鹽堿等方面也有一定的作用。大豆是較難轉(zhuǎn)化的作物之一,這主要是由于大豆組織培養(yǎng)再生困難、可重復(fù)性差、基因型之間差異大等原因造成。本試驗(yàn)的
2、目的是研究復(fù)合注射針介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化方法,并利用復(fù)合針介導(dǎo)法進(jìn)行CBF1基因轉(zhuǎn)化大豆的研究。
通過對影響復(fù)合注射針刺傷大豆種子萌發(fā)率主要因素的研究發(fā)現(xiàn):無菌水浸泡大豆8h,復(fù)合注射針針刺1次和添加3mg/L的AgNO3時,大豆種子的萌發(fā)率最高,達(dá)到93.1%。農(nóng)桿菌侵染大豆的萌發(fā)率比沒有農(nóng)桿菌侵染的有了明顯的下降,從93.1%降至88.2%。
為了研究復(fù)合注射針針刺大豆子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo)率重要因素的影響,本試
3、驗(yàn)進(jìn)行了大豆萌發(fā)時間、復(fù)合注射針針刺次數(shù)及添加不同濃度AgNO3三個處理,得出了大豆子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo)率最高的條件:即大豆萌發(fā)時間為5d,針刺1次和添加3mg/L的AgNO3。誘導(dǎo)率達(dá)到66.7%。農(nóng)桿菌侵染大豆的誘導(dǎo)率比沒有農(nóng)桿菌侵染的大豆有了明顯的下降,從66.7%降至47.0%。
復(fù)合針介導(dǎo)下對大豆轉(zhuǎn)化CBF1基因進(jìn)行了研究:
首先是載體構(gòu)建,先將pCAMBIA1301和PROK2進(jìn)行EcoRⅠ和Hind
4、Ⅲ雙酶切,將含有啟動子和終止子片段連接到pCAMBIA1301,構(gòu)成pCAM-ROK2中間載體,然后通過KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切pCAM-ROK2和PROK2-CBF1再進(jìn)行連接,構(gòu)建成pCAM-ROK2-CBF1。該載體的T-DNA上具有潮霉素抗性基因、gus報告基因及CBF1基因。CBF1基因是由CaMV35S啟動子啟動。
將農(nóng)桿菌浸染的半片種子在共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3-5d后,在無篩選劑的培養(yǎng)基上(含250mg/L的羧
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