農(nóng)桿菌介導(dǎo)的柑橘轉(zhuǎn)CBF類似基因及檢測(cè).pdf

1、柑橘是世界第一大果樹,在我國(guó)果樹產(chǎn)業(yè)中具有重要的地位。但是,周期性的凍害嚴(yán)重影響了柑橘的產(chǎn)量和品質(zhì),培育抗寒品種是解決該問(wèn)題的有效途徑之一。然而,柑橘屬植物具有多胚性、遺傳高度雜合、童期長(zhǎng)、雌雄性敗育等特點(diǎn)。柑橘基因工程以及在此基礎(chǔ)上的柑橘遺傳轉(zhuǎn)化為縮短育種周期、獲得抗寒、優(yōu)質(zhì)柑橘種質(zhì)資源提供了新的途徑。
　　 CBF(CRT/DRE(C-repeat/dehydration responsive element)binding

2、 factor)是一種調(diào)控一系列植物冷馴化相關(guān)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,在低溫誘導(dǎo)下迅速合成,與下游基因啟動(dòng)子上的CRT/DRE元件結(jié)合,促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而合成糖類、脯氨酸和膜蛋白等物質(zhì),提高植物的抗寒性?；蜣D(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證明,CBF基因在擬南芥和油菜等植物中超表達(dá),使轉(zhuǎn)基因植株的低溫耐性顯著增強(qiáng)。這一發(fā)現(xiàn)為利用基因工程手段提高植物耐寒性提供了新途徑。
　　 本研究的目的是:利用分子生物學(xué)手段分別構(gòu)建枳(Poncirus trifoli

3、ata(L.)Raf.)Ptcbfa、Ptcbf1兩個(gè)基因的超量和抑制表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化柑橘屬植物和煙草(Nicotianatabacum L.),以期揭示柑橘中的CBF低溫應(yīng)答途徑,為培育優(yōu)良的柑橘抗寒新品種奠定基礎(chǔ)。本研究獲得的主要結(jié)果如下:
　　 1.Ptcbfa基因表達(dá)載體的構(gòu)建。超量表達(dá)載體的構(gòu)建(4PMVCBFa):將克隆得到的Ptcbfa基因,前面連接CaMV35s啟動(dòng)子,后面連接Nos終止子,得到超量表達(dá)載體；RN

4、Ai干涉載體的構(gòu)建(4DHRCBFa):在GcnBank中,將Ptcbfa基因與其它植物基因序列比對(duì)分析,選擇與其它物種中無(wú)同源性的一段片段,與空干涉載體DHRVP同源重組,使得這一片段分別以正向和反向連接于載體上,且中間由載體上原來(lái)存在的一段Intron內(nèi)含子片段隔開,前面連接CaMV35s啟動(dòng)子,后面連接Nos終止子,得到干涉載體。
　　 2.用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法,將構(gòu)建好的4PMVCBFa載體對(duì)檸檬(Citrus lim

5、on(L.)Burm cv.Eureka)進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的檸檬再生植株,分別做了PCR和Southern鑒定,經(jīng)鑒定,轉(zhuǎn)基因植株具有較高的再生率和陽(yáng)性率。
　　 3.對(duì)轉(zhuǎn)化Ptcbfa基因超量表達(dá)載體的檸檬植株,測(cè)定了部分反應(yīng)抗寒性強(qiáng)弱的指標(biāo)。以未轉(zhuǎn)化檸檬植株為對(duì)照,測(cè)定了轉(zhuǎn)化和對(duì)照檸檬植株中,經(jīng)不同低溫處理后的蔗糖、葡萄糖、果糖、肌醇、蘋果酸、檸檬酸等的含量,并測(cè)定了兩者的電導(dǎo)率,然后做了半定量RT-PCR分析。所得結(jié)果表

6、明,轉(zhuǎn)Ptcbfa基因的檸檬植株抗寒性有所提高,有望進(jìn)行下一步的研究。
　　 4.將構(gòu)建好的Ptcbfa基因的兩個(gè)載體,用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法,對(duì)椪柑(Citrusreticulata Blanco)、煙草進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化,并且獲得了部分轉(zhuǎn)化植株,有待進(jìn)一步的研究。
　　 5.克隆了幾個(gè)不同柑橘品種,橙(Citrus sinensis Osbeck)、柚(Citrus grandisOsbeck)、檸檬中的cbf1基因,核

7、苷酸和氨基酸序列比對(duì)表明,枳、橙、柚、檸檬幾個(gè)品種中的cbf1基因存在明顯的差異。經(jīng)RT-PCR實(shí)驗(yàn)分析,發(fā)現(xiàn)檸檬與另幾個(gè)品種cbf1的表達(dá)有很大差異。
　　 6.研究了Ptcbf1基因在枳中的表達(dá)特性,發(fā)現(xiàn)Ptcbf1基因具有冷誘導(dǎo)表達(dá)的特性,但存在一定的組成型表達(dá),低溫誘導(dǎo)時(shí),表達(dá)先逐漸增強(qiáng)后又逐漸降低。
　　 7.研究了包括cbf1基因在內(nèi)的幾個(gè)冷相關(guān)基因,在兩個(gè)抗寒性不同的柑橘品種(枳和椏柑)中的低溫表達(dá)特性,發(fā)

8、現(xiàn)這幾個(gè)基因在枳中對(duì)低溫反應(yīng)較在椏柑中要敏感。在枳中,隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng),幾個(gè)冷相關(guān)基因的表達(dá)量有明顯的升降趨勢(shì),而在椏柑中,表達(dá)量變化幅度不是很大。
　　 8.構(gòu)建了Ptcbf1基因的超量表達(dá)載體和RNAi抑制表達(dá)載體,分別命名為:5PMVCBF1、5DHRCBF1。
　　 9.利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法,對(duì)檸檬和煙草進(jìn)行了5PMVCBF1載體的轉(zhuǎn)化；對(duì)椪柑同時(shí)進(jìn)行了5PMVCBF1和5DHRCBF1兩個(gè)載體的轉(zhuǎn)化,