苜蓿根瘤菌遺傳多樣性研究及根瘤菌資源網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建.pdf

1、本研究對采自云南省楚雄州、德宏州、玉溪市、文山州及紅河州部分地區(qū)的南苜蓿（Medicago polymorpha）、天藍苜蓿（M.lupulina）紫花苜蓿（M.sativa）根瘤進行了分離，獲得了189株根瘤菌，選擇其中的94株及6株參比菌株作為供試菌進行16S rDNA PCR-RFLP、16S～23S rDNA IGS PCR-RFLP及BOX-PCR指紋圖譜分析。選擇30株供試菌株與宿主南苜蓿進行結(jié)瘤試驗，并采用BOX-PCR指

2、紋圖譜作為分子標(biāo)記對其結(jié)瘤能力進行了驗證。再對7株代表菌株進行了16S rDNA序列分析。基于BOX-PCR指紋圖譜分析的數(shù)據(jù)，對供試菌株進行了遺傳多樣性指數(shù)分析；最后根據(jù)研究獲得的結(jié)果制定了根瘤菌菌種信息元數(shù)據(jù)標(biāo)準，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了根瘤菌資源網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫。得到的結(jié)果及結(jié)論如下：
　　 16S rDNA PCR-RFLP分析顯示，91株根瘤菌的16S rDNA酶切圖譜類型與草苜蓿劍菌（Ensifer meliloti）USDA1

3、002T完全相同，它們可能為劍菌屬根瘤菌；SWF67307、SWF67367和SWF67402三株菌的圖譜類型與所有參比菌株不同。
　　 經(jīng)16S～23S rDNA IGS PCR-RFLP分析發(fā)現(xiàn)，供試菌株主要有a型和b型兩種酶切圖譜，其中a型有61株，占供試菌株的69％，b型有24株，占供試菌株的27％，其余酶切圖譜類型所占比例較小。
　　 BOX-PCR指紋圖譜分析中，所有菌株共具有41種圖譜類型，聚類分析顯示，在

4、40％的似性水平上，所有供試菌株聚為一群，在48％左右的相似性水平上，供試菌株可以分為三群，而在68％的相似性水平上，供試菌株則細分為8個遺傳群，除SWF67371和SWF67402二株菌未聚群外，其余菌株大部分按宿主及采集地聚在一起，但也有交叉。
　　 經(jīng)過對30株菌株的結(jié)瘤試驗及其結(jié)瘤菌株的BOX-PCR指紋圖譜驗證表明菌株SWF65100、SWF67307、SWF67367、SWF67402、SWF67340、SWF674

5、57和SWF67464不能與南苜蓿形成根瘤，它們的結(jié)瘤能力還有待進一步研究。
　　 基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，7株代表菌分別與E.medicae和E.meliloti的親緣關(guān)系較近，其中SWF65100、SWF67350、SWF67457和SWF67501相近于E.medicae系統(tǒng)發(fā)育分枝，SWF66437、SWF67523和SWF67524與E.meliloti關(guān)系密切。
　　 綜合16S～23S

6、 rDNA IGS PCR-RFLP及16S rDNA序列分析的結(jié)果可知，具有a型16S～23S rDNA IGS酶切圖譜的供試菌株歸屬于E.medicae種群，而具有b型或g型16S～23S rDNA IGS酶切圖譜的供試菌株屬于E.meliloti種群。
　　 基于BOX-PCR指紋圖譜的遺傳多樣性指標(biāo)分析表明E.meliloti的遺傳多樣性水平高于E.medicae。在E.medicae各居群中，PPB、Nei’s遺傳多樣

7、性指數(shù)及Shannon's信息指數(shù)等多樣性指標(biāo)最高的為祿豐腰站居群，最低的為小哨居群，對各采集地間的Nei's遺傳距離與實際地理距離進行相關(guān)性分析，得到相關(guān)系數(shù)為0.433516，表明Nei’s遺傳距離與實際地理距離低度相關(guān)，各居群間的遺傳分化系數(shù)（GST）較小為0.1908，基因流（Nm）較大為2.1203，表明遺傳變異主要存在于居群內(nèi)。
　　 E.meliloti各居群的PPB、Nei's遺傳多樣性指數(shù)及Shannon's信

8、息指數(shù)等多樣性指標(biāo)最高的為祿豐金山居群，而個舊居群的最低；各居群間的遺傳距離與實際地理距離不相關(guān)；居群間的遺傳分化系數(shù)（GST）為0.6208，從GST，估計的基因流（Nm）為0.3054，各居群間可能由于遺傳漂變發(fā)生了分化。
　　 基于研究中所獲得的根瘤菌特征信息，參考相關(guān)資料制定了描述根瘤菌菌種的元數(shù)據(jù)標(biāo)準，該元數(shù)據(jù)庫標(biāo)準分為菌株描述、宿主描述、采集地描述和培養(yǎng)基描述四個部分。
　　 以制定的元數(shù)據(jù)標(biāo)準為基礎(chǔ)構(gòu)建了基

9、于JSP+SQL Server的B/S結(jié)構(gòu)的根瘤菌資源網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，實現(xiàn)了對根瘤菌基本信息、表型信息、遺傳型信息、宿主信息及采集地信息的添加、刪除、更新及查詢等管理功能。
　　 本研究對幾種苜蓿根瘤菌菌株資源進行了挖掘和保存，揭示了這些苜蓿根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育及遺傳多樣性信息，并分析了遺傳多樣性與宿主、采集地的關(guān)系，為高效菌株固氮結(jié)瘤菌株的篩選提供了充裕的根瘤菌菌株資源，并為高效菌株應(yīng)用研究中涉及到的宿主、施用地、分子標(biāo)記等問題的解決