植酸酶基因在Pichia pastoris中的表達(dá)及發(fā)酵條件初步優(yōu)化.pdf

1、植酸酶（EC．3．1．3．8）是催化植酸及植酸鹽水解成肌醇與磷酸（或磷酸鹽）的一類酶的總稱，屬于酸性磷酸酶的一個(gè)亞類，在飼料行業(yè)極具應(yīng)用價(jià)值。人們?yōu)楂@得經(jīng)濟(jì)廉價(jià)的植酸酶用于動(dòng)物飼料添加劑作出了很大的努力。目前已篩選得到許多產(chǎn)植酸酶的物種，包括植物、動(dòng)物和微生物（特別是真菌和細(xì)菌）。 相對于已有的基因克隆策略，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了一種通過CODEHOP PCR和TAIL-PCR聯(lián)用克隆植酸酶基因的方法。以Aspergillus niger

2、和Aspergillus orzae的總RNA分別反轉(zhuǎn)錄獲得其所表達(dá)基因的第一鏈cDNA。以第一鏈cDNAs為模板，克隆得到了包含Aspergillus niger和Aspergillus oryzae植酸酶全長基因以及部分5'UTR和3'UTR的序列。并設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出Aspergillus niger、Aspergillus oryzae植酸酶蛋白成熟肽編碼區(qū)（不含信號(hào)肽序列），在Pichia pastoris GS115中實(shí)現(xiàn)甲醇誘

3、導(dǎo)的整合分泌表達(dá)。對表達(dá)的產(chǎn)物進(jìn)行的性質(zhì)分析顯示，A．niger rPhyA和A。oryzae rPhyA這兩個(gè)真菌植酸酶基因均屬于組氨酸酸性磷酸酶家族。 在實(shí)驗(yàn)室水平上，畢赤酵母工程菌表達(dá)這兩株植酸酶均實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，在最適溫度50℃，最適pH值5．5條件下，A．niger rPhyA和A．oryzae rPhyA的植酸酶活性分別達(dá)到680U/ml和400U/ml。針對工業(yè)生產(chǎn)中的實(shí)際問題，從構(gòu)建的工程菌株里面選擇酶活高、具有