凋亡抑制因子Survivin的基因克隆及其在Pichia pastoris中的表達(dá).pdf_第1頁(yè)
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1、目的1、建立并利用畢赤酵母Pichia pastoris真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)凋亡抑制因子Survivin蛋白.方法1、利用Survivin的特異引物,通過(guò)PCR法從重組質(zhì)粒pGEX-4T-3-HA-Survivin中擴(kuò)增人Survivin基因的DNA全長(zhǎng),并將Survivin基因克隆于pGEM-T載體,進(jìn)行序列測(cè)定;2、將序列正確的Survivin基因與穿梭載體pPic9k重組,大量擴(kuò)增重組體后,將重組體酶切線性化,通過(guò)電穿孔法轉(zhuǎn)入酵母宿主

2、菌HIS-/GS115細(xì)胞中,然后在含不同濃度G418的YPD平板上,篩選陽(yáng)性克隆.再提取陽(yáng)性克隆細(xì)胞的基因組DNA,用PCR擴(kuò)增法鑒定陽(yáng)性克隆;3、用含1％甲醇的BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)蛋白,最后用ELISA法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物.結(jié)果1、擴(kuò)增出的人Survivin片段測(cè)序的結(jié)果,與Gen-Bank中的Survivin基因序列對(duì)比,序列完全一致,無(wú)突變.2、構(gòu)建了真核表達(dá)載體pPic9k-Survivin,并將酶切線性化的重組載體轉(zhuǎn)入酵母菌HI

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