受葉銹菌侵染的小麥葉片細(xì)胞間隙液中抗病相關(guān)蛋白的鑒定.pdf

1、本試驗(yàn)以小麥(Triticum aestivum)品種洛夫林10、5389和葉銹菌（Puccinia triticina）生理小種260 為研究對象，分別提取親和組合（5389×260）接菌后五天以及不親和組合（洛10×260）接菌后三天的小麥葉片細(xì)胞間隙液（IWF），將其注射到小麥幼苗葉片中，測定被注射葉片的PAL、PO活性及過敏性反應(yīng)（HR）面積，并觀察對隨后接種的葉銹菌菌絲擴(kuò)展的影響以及IWF 對葉銹菌孢子萌發(fā)的影響。結(jié)果表明，無

2、論來自親和組合或不親和組合的小麥細(xì)胞間隙液均能誘導(dǎo)小麥PAL，PO活性升高和產(chǎn)生HR，而且來自不親和組合的細(xì)胞間隙液所誘導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)活性要明顯高于親和組合。IWF 對隨后接種的表現(xiàn)親和互作的葉銹菌菌絲擴(kuò)展也有一定抑制作用，并且也能抑制孢子的萌發(fā)，初步證明了IWF中存在抗葉銹菌相關(guān)的物質(zhì)。
　　 為了進(jìn)一步分離獲得小麥細(xì)胞間隙液中與誘導(dǎo)防衛(wèi)反應(yīng)及抗葉銹菌相關(guān)的物質(zhì)，以不親和組合的細(xì)胞間隙液為研究對象，以小麥健葉細(xì)胞間隙液為對照，利

3、用雙向電泳技術(shù)進(jìn)行鑒定。首先建立了一套適用于小麥葉片細(xì)胞間隙液蛋白質(zhì)分析的雙向電泳體系。
　　 本試驗(yàn)確定了用50％TCA法沉淀細(xì)胞間隙液的蛋白質(zhì)，適宜的蛋白上樣量為800μg，主動水化12h，通過不同pH范圍膠條的選擇確定了細(xì)胞間隙液蛋白主要分布在pI4-7之間，一向到二向過渡時平衡時間為15min，最終獲得了重復(fù)性好，分辨率高的蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，不親和組合的小麥葉片細(xì)胞間隙液被誘導(dǎo)產(chǎn)生大量新的蛋白質(zhì)。對其中顯著

4、的兩個蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫檢索，發(fā)現(xiàn)分別與β-1,3-葡聚糖內(nèi)切酶和β-1,3-葡聚糖酶前體具有較高的同源性，推測β-1,3-葡聚糖酶可能在誘發(fā)小麥對葉銹菌的抗性反應(yīng)中發(fā)揮作用。
　　 為進(jìn)一步驗(yàn)證β-1,3-葡聚糖酶是否在小麥抗葉銹菌侵染過程中發(fā)揮作用，首先測定了接菌后不同時間點(diǎn)不同親和性組合細(xì)胞間隙液中β-1,3-葡聚糖酶的活性，結(jié)果表明不親和組合的β-1,3-葡聚糖酶活性始終高于親和組合，并在4h和72h 出現(xiàn)兩個高

5、峰，說明β-1,3-葡聚糖酶在小麥早期抵抗葉銹菌的侵染過程中可能發(fā)揮重要作用。隨后，將葉銹菌孢子培養(yǎng)到含有一定濃度的外源β-1,3-葡聚糖酶的水培液中，發(fā)現(xiàn)孢子萌發(fā)并沒有受到抑制，仍然長出芽管，說明其在體外并不能抑制孢子的萌發(fā)。再向小麥葉片中注射外源β-1,3-葡聚糖酶，并接菌，觀察對菌絲擴(kuò)展和HR的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明外源β-1,3-葡聚糖酶在親和組合中可以抑制菌絲的生長，在不親和組合中可以將出現(xiàn)HR的時間提前，且HR 面積減小。以上試