鈣調(diào)素參與小麥抵抗葉銹菌侵染的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的研究.pdf

1、鈣調(diào)素(Calmodulin，CaM)是一種重要的Ca2+結(jié)合蛋白，Ca2+/CaM是目前植物細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中研究得最為深入和廣泛的途徑之一。本實驗室以小麥-葉銹菌互作體系為研究對象，前期工作已經(jīng)證明小麥-葉銹菌互作表現(xiàn)親和或不親和的差異不僅取決于抗病基因的有無，還取決于防衛(wèi)基因、防衛(wèi)反應(yīng)的表達在時間、空間和強度上的差異。而且通過胞外鈣及鈣調(diào)素濃度的變化、鈣信使阻斷或激活藥物試驗、鈣離子的亞細胞定位、激發(fā)子刺激抗病性不同的小麥品種葉肉

2、細胞原生質(zhì)體后胞質(zhì)Ca2+變化研究證明Ca2+參與了小麥抵抗葉銹菌侵染的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，且此過程中Ca2+濃度升高可能主要來源于胞外。但是小麥CaM是否也參與了這一過程還不清楚。本研究以小麥-葉銹菌互作體系為研究對象，利用小麥(Triticum aestivumL)品種洛夫林10分別和葉銹菌(Puccinia triticina)生理小種260、165組成不親和組合和親和組合，試圖查明CaM是否參與小麥抵抗葉銹菌侵染的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，并初步

3、研究可能是哪一種亞型發(fā)揮作用。
　　 首先通過研究鈣調(diào)素拮抗劑對葉銹菌誘導(dǎo)的小麥過敏性反應(yīng)(hypersensitive reaction，HR)的影響及小麥-葉銹菌互作早期小麥鈣調(diào)素表達的western blotting檢測，初步探討鈣調(diào)素是否參與小麥抵抗葉銹菌侵染的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。結(jié)果表明在小麥品種洛10葉片上分別注射不同濃度的鈣調(diào)素拮抗劑三氟拉嗪(Trifluonerazine，TFP)和氯丙嗪(Chlorpromazine

4、，CPZ)后，立即接種葉銹菌小種260，TTP和CPZ均可以在一定程度上抑制小麥受葉銹菌侵染誘發(fā)的過敏性反應(yīng)的發(fā)生，而且隨著濃度升高，抑制作用增強。Western blotting檢測顯示不親和組合中鈣調(diào)素表達量與對照相比接種后4h已表現(xiàn)增加，接種后8h表達量達最高，隨后開始下降，接種后12h基本降到對照水平，而后又稍有增加。而親和組合接種后不同時間點的鈣調(diào)素表達量與對照相比無明顯差異。以上兩方面結(jié)果初步證明在小麥-葉銹菌不親和互作早期

5、，鈣調(diào)素即被誘導(dǎo)表達，參與小麥抵抗葉銹菌侵染的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。
　　 在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用實時定量PCR技術(shù)，進一步研究小麥中已知的10個CaM基因在接種葉銹菌后不同時間點的相對表達量，探討小麥在抵抗葉銹菌侵染過程中涉及到哪些CaM基因的參與。結(jié)果表明TaCaM2-J在不親和組合中接種后4h表達量明顯高于對照及親和組合，達對照的8.5倍，而后相對表達量逐漸下降，到接種后16h基本降到對照水平，20h開始又逐漸增加，到接種后48h表達量

6、為對照的5.6倍。其它9個小麥CaM基因在不親和組合及親和組合中的表達量與對照無明顯差異。這說明TaCaM2-1可能參與了小麥抵抗葉銹菌侵染的早期信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。
　　 另外本試驗還試圖利用雙向電泳技術(shù)從蛋白水平進一步分析參與小麥-葉銹菌早期互作的鈣調(diào)素亞型。首先建立了適用于植物鈣調(diào)素亞型分析的雙向電泳方法，即利用可溶性蛋白提取緩沖液得到小麥幼苗葉片中的可溶性蛋白，90℃下加熱3min處理去除雜蛋白，然后利用丙酮沉淀法獲得蛋白干粉