受松-楊柵銹菌侵染的楊樹miRNA表達(dá)特征及其調(diào)控作用.pdf

1、楊樹葉銹病是由落葉松-楊柵銹菌（Melampsoralarici-popul ina）引起的非常嚴(yán)重的一種楊樹病害，在世界范圍內(nèi)造成重大損失。microRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)20～24 nt的小分子單鏈非編碼RNA，能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化、新陳代謝及響應(yīng)生物和非生物脅迫等過程。楊樹作為重要的的模式樹種，對(duì)于miRNA的研究已經(jīng)非常深入。國(guó)內(nèi)外對(duì)楊樹非生物脅迫下的miRNA研究主要集中在冷、熱、干旱、高鹽、機(jī)械壓

2、力脅迫下miRNA的種類及其調(diào)控作用。但是在楊樹生物脅迫尤其是世界性重大病害的銹菌侵染下的miRNA的研究較少。本文通過高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析，鑒定受松-楊柵銹菌侵染下的川楊miRNA的種類，預(yù)測(cè)miRNA的靶基因，并對(duì)其中與抗病相關(guān)的靶基因進(jìn)行驗(yàn)證，最后構(gòu)建miRNA過表達(dá)載體，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入楊樹，從而深入了解楊樹受病原菌侵染時(shí)miRNA的調(diào)控作用。主要研究結(jié)果如下:
　　1.受銹菌侵染川楊miRNA多樣性

3、r>　　構(gòu)建非親和與親和性楊樹-柵銹菌互作條件下的楊樹sRNA文庫(kù)，進(jìn)行高通量測(cè)序。在三個(gè)文庫(kù)中共鑒定得到90個(gè)已知的miRNAs，屬于42個(gè)家族，來自313個(gè)基因組位點(diǎn)。豐度高的已知miRNA家族有MiR156、MiR166、MiR167、MiR168等，這些miRNAs在不同物種中高度保守。用Mireap軟件一共預(yù)測(cè)出378個(gè)新的miRNAs，來自508個(gè)基因組位點(diǎn)。豐度高的miRNA有novel_mir_75、novel_mir_

4、144、novel_mir_91等。
　　用qRT-PCR進(jìn)一步分析川楊受落葉松-楊柵銹菌侵染后0、12、24、48、96和144 h10個(gè)miRNAs的時(shí)間動(dòng)態(tài)表達(dá)水平。結(jié)果表明miRNA的表達(dá)水平隨著銹菌病程的發(fā)展而變化，且在不同菌系侵染下存在差異。在接種無(wú)毒菌株Sb052后大部分miRNAs在48 hpi上調(diào)，相反，在毒性菌株Th053侵染48 hpi大部分miRNAs下調(diào)。從這些結(jié)果推測(cè)，miRNA可能通過改變某些miRN

5、A的表達(dá)，來間接調(diào)節(jié)相關(guān)防衛(wèi)基因的表達(dá)，在銹菌侵染楊樹后發(fā)揮重要作用。
　　2.川楊miRNA靶基因預(yù)測(cè)和功能注釋
　　采用華大基因自主研發(fā)的程序在三個(gè)文庫(kù)中預(yù)測(cè)了大量的靶基因，對(duì)這些靶基因進(jìn)行KEGG通路注釋分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)于已知miRNAs，占總靶基因百分比最多的途徑是新陳代謝途徑，然后是植物-病原菌互作途徑;而對(duì)于新的miRNA，占靶基因最多的途徑是植物-病原菌互作途徑，新陳代謝途徑次之。因此，在楊樹受到病原菌侵染后，主要

6、是植物-病原菌互作和新陳代謝途徑起作用。
　　對(duì)三個(gè)文庫(kù)中的miRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析，一共鑒定出38個(gè)已知的和92個(gè)新的miRNAs差異表達(dá)，這些miRNAs在響應(yīng)病原菌脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用。相同miRNA的表達(dá)水平在不同的銹菌處理下表達(dá)不同，且在銹菌侵染下川楊miRNAs的表達(dá)水平更多的表現(xiàn)為抑制。在差異表達(dá)的miRNAs中，有27個(gè)（20個(gè)新的和7個(gè)已知的）miRNAs的靶基因與銹菌侵染有關(guān)，通過KEGG pathway注釋發(fā)

7、現(xiàn)這些靶基因主要是調(diào)控編碼抗病蛋白、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子和其他相關(guān)蛋白的基因。
　　3.靶基因驗(yàn)證及miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控
　　用RLM-5，RACE驗(yàn)證與病害相關(guān)的miR482a的靶基因RPM1和RPS2及切割位點(diǎn)，結(jié)果表明miR482a與兩個(gè)靶基因mRNA均在特定位點(diǎn)互補(bǔ)，miR482a對(duì)RPM1在一個(gè)位點(diǎn)切割，但是，它對(duì)RPS2的切割位點(diǎn)有兩個(gè)。且RPM1和RPS2與數(shù)據(jù)庫(kù)中毛果楊的NBS-LRR類家族蛋

8、白基因相似性較高。
　　對(duì)靶基因RPS2進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增和生物信息學(xué)分析，獲得3012 bp的全長(zhǎng)序列，編碼751個(gè)氨基酸，包含2256 bp的開放閱讀框。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)其具有NBS-LRR類抗病基因典型的NB-ARC和LRR結(jié)構(gòu)域。靶基因編碼的預(yù)測(cè)蛋白在NCBI中進(jìn)行ProteinBLAST，序列比對(duì)結(jié)果揭示該序列與毛果楊的推測(cè)抗病基因NBS-LRR家族蛋白相似性最高，因此推測(cè)該靶基因是NBS-LRR類抗病蛋白基因。
　　

9、采用qRT-PCR技術(shù)，檢測(cè)在葉銹菌侵入的不同時(shí)段，川楊葉片miRNA及其抗病相關(guān)靶基因的時(shí)間動(dòng)態(tài)表達(dá)，結(jié)果表明miR482負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)，在親和互作和非親和互作中存在差異。miR482a對(duì)靶基因的調(diào)控可能發(fā)生在侵染的后期(96 hpi～144 hpi)，引起川楊葉片對(duì)柵銹菌不同反應(yīng)型的差異。
　　4.miR482過表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的川楊遺傳轉(zhuǎn)化
　　從川楊基因組中克隆miR482a前體DNA片段，并將其連接到

10、植物表達(dá)載體pBI121，通過凍融法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，成功構(gòu)建miR482a過表達(dá)載體，用于川楊遺傳轉(zhuǎn)化。組培苗愈傷組織誘導(dǎo)和生根培養(yǎng)基最適激素濃度組合分別為MS+6-BA1.0 mg/L+α-NAA0.2 mg/L和1/2MS+α-NAA0.02 mg/L。選擇川楊葉片作為外植體，在上述激素組合培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到川楊組培苗，并移栽成功，為川楊的遺傳轉(zhuǎn)化提供材料。遺傳轉(zhuǎn)化過程中，誘導(dǎo)愈傷組織和生根選用的卡那霉素濃度分別為10 m