內(nèi)生芽孢桿菌及抗菌物質(zhì)的鑒定和對作物黃萎病的防治效果.pdf

1、大麗輪枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）在世界上很多地區(qū)造成多種作物，其中包括棉花(Gossypium hirsutum L.)和茄子(Solanum melongena L.)，發(fā)生微管束萎蔫病害。由該病菌引起的黃萎病已成為嚴重危害我國棉花和茄子生產(chǎn)的制約因素之一。利用內(nèi)生細菌作為生防菌來防治土傳微管束病害具有獨特的優(yōu)勢，是很有應(yīng)用前景的防治措施。
　　 我們從茄子莖組織中分離獲得一株內(nèi)生細菌Jaas

2、 ed1，其菌體和無細胞濾液對大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）都有很強的拮抗活性。根據(jù)形態(tài)特性、生理生化特性和16s rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillius subtilis），其16s rDNA序列在GenBank上的登錄號為EF178293。通過平板法測定，內(nèi)生枯草芽孢桿菌Jaas ed1可產(chǎn)生揮發(fā)性抗菌物質(zhì)、嗜鐵素和蛋白酶，但不產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。對內(nèi)生枯草芽孢桿菌Jaas ed1的

3、胞外抗菌粗提物進行理化性質(zhì)測定，結(jié)果表明其胞外抗菌粗提物的抗菌活性對熱穩(wěn)定，耐堿性不耐酸性，對蛋白酶K和胰蛋白酶都不敏感。抑菌譜測定表明該胞外抗菌粗提物對10種病原真菌和1種病原細菌都具有拮抗作用。在光學顯微鏡下觀察，經(jīng)該胞外抗菌粗提物處理的大麗輪枝菌部分菌絲細胞異常膨大，細胞膜破裂，細胞質(zhì)外泄。進一步將內(nèi)生枯草芽孢桿菌Jaas ed1的培養(yǎng)液離心后的上清液，通過硫酸銨沉淀、Sephedex G-25分子篩層析、Cellulose DE

4、AE-52陰離子交換層析、FPLC300SB-C18反相層析，獲得在Tricine-SDS-PAGE上顯示為分子量遠小于6.5 KD的一條帶的抗菌物質(zhì)。再通過電噴霧四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(Q-TOF2)分析發(fā)現(xiàn)，該抗菌物質(zhì)包含有兩個分子量相差14 Da脂肽類化合物系列，推測為3個Fengycin家族同系物和4個Surfactin-like compound同系物。進一步用Q-TOF2測序鑒定其中m/z718.38（雙電荷離子）的物質(zhì)為C

5、-14 fengycinA。
　　 通過灌根接種內(nèi)生枯草芽孢桿菌Jaas ed1的Rif突變菌株Jaas ed1R，發(fā)現(xiàn)菌株Jaased1R能夠從根部進入植株，并能迅速向上轉(zhuǎn)移到莖和葉中。我們推測該菌株能夠定殖在植物的微管束組織中，從而快速擴散到整個植株。溫室盆栽試驗表明，內(nèi)生枯草芽孢桿菌Jaas ed1的菌體細胞懸浮液和無細胞濾液都對茄子黃萎病有一定的防治效果，但菌體細胞懸浮液的防治效果顯著高于無細胞濾液。因此，不但內(nèi)生枯草芽

6、孢桿菌Jaased1產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)具有生防作用，而且細菌本身在植株中的定殖可能是其能夠有效防治茄子黃萎病的一個重要因素。此外，無論接種內(nèi)生枯草芽孢桿菌Jaas ed1菌體細胞懸浮液，還是其無細胞濾液都未在茄子植株上觀察到任何病害癥狀。將內(nèi)生枯草芽孢桿菌Jaas ed1作為可用于田間防治茄子黃萎病的生防菌劑還需要進一步進行田間大面積應(yīng)用試驗。
　　 另外，我們對原有的一株棉花黃萎病生防內(nèi)生細菌Jaas cd（原名73a）進行了菌種

7、鑒定和田間應(yīng)用方式的改進。通過形態(tài)觀察、生理生化鑒定、Biolog鑒定以及16SrDNA序列比對，表明菌株Jaas cd為多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa），其16S rDNA序列在GenBank上的登錄號為AY942618。抑菌譜測定表明，內(nèi)生多粘芽孢桿菌Jaas cd對12種病原真菌均有較強的抑制作用。比較內(nèi)生多粘芽孢桿菌Jaas cd和土壤拮抗細菌JB52以及化學藥劑黃腐酸綠源寶單獨使用、混合使用對棉苗

8、生長、棉花產(chǎn)量的影響以及對棉花黃萎病的防治效果，結(jié)果表明無論將內(nèi)生多粘芽孢桿菌Jaas cd與拮抗細菌JB52混用還是與黃腐酸綠源寶混用都不如單獨使用效果好。內(nèi)生多粘芽孢桿菌Jaas cd的促生長作用最強，棉花苗期株高可增長29.9％，鮮重可增加45.2％，田間試驗可增產(chǎn)11.5％，并且用內(nèi)生多粘芽孢桿菌Jaas cd的菌液灌根對棉花黃萎病的防治效果也最好，在7月底和9月初的防效分別達到51.17％和49.90％。田間大區(qū)示范試驗表明用