多酚氧化酶抑制劑對菜青蟲的防效及其毒理學研究.pdf

1、昆蟲多酚氧化酶(EC.1.14.18.1，Phenoloxidase，簡稱PPO)，又稱酚氧化酶，酪氨酸酶，是昆蟲體內酪氨酸代謝的關鍵酶，與黑色素的形成、昆蟲蛹化、蛻皮時的鞣化、表皮硬化等直接相關，通過抑制害蟲的多酚氧化酶活力將影響其幼蟲的發(fā)育。該酶可以作為新型農藥的作用靶標，而該酶的抑制劑則可發(fā)展成為具有應用前景的新型的病蟲害殺蟲劑。在本研究中我們以農作物重要鱗翅目害蟲菜青蟲的多酚氧化酶作為研究對象，檢測合成的縮氨基硫脲化合物對其活力

2、的影響，并在此基礎上合成多種結構的縮氨基硫脲和3，4-二羥基苯甲酸酯類化合物，進一步驗證其對菜青蟲多酚氧化酶抑制作用及殺蟲效能。同時克隆菜青蟲的多酚氧化酶基因，研究效應物對該基因表達的影響。這對于多酚氧化酶劑制劑在農藥上的應用具有重要的理論意義和實際應用價值。主要實驗結果如下：
　　 1.用苯甲醛縮氨基硫脲類化合物作為抑制劑，研究其對菜青蟲酚氧化酶的抑制動力學。結果表明，合成的四種苯甲醛縮氨基硫脲類化合物對菜青蟲酚氧化酶抑制作用

3、的IC50分別為0.5、0.6、4和10μmol/L；其動力學研究結果表明：這四種化合物均為可逆的混合型抑制劑，其抑制常數(shù)(K1)分別為0.059、0.047、0.033和0.036 mmol/L。這為進一步設計新的高生物活性、低毒、副作用小的酚氧化酶抑制劑提供了一定的參考依據(jù)，因而合成的化合物在農業(yè)殺蟲劑領域具有廣泛的應用前景。
　　 2.采用乙醇與水作為溶劑，冰醋酸作為催化劑，在加熱回流的條件下成功的合成了7種縮氨基硫脲類化

4、合物，并采用質譜和核磁共振對結構進行了鑒定。選擇了糠醛縮氨基硫脲(A1)、對氰基苯甲醛縮氨基硫脲(A2)、對氯苯甲醛縮氨基硫脲(A3)、4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲(A4)、2，4-二羥基苯甲醛縮氨基硫脲(A5)、3，4-二羥基苯甲醛縮氨基硫脲(A6)、3-溴-4-羥基-5-甲氧基苯甲醛縮氨基硫脲(A7)作為效應物，研究了它們對菜青蟲酚氧化酶粗提液活力的影響，研究表明，效應物都對菜青蟲多酚氧化酶有良好的抑制效應，由于其苯環(huán)上的取代基與取代

5、位置不同，其抑制效應也有差異。
　　 3.采用EDC·HCl催化縮合的方法合成3，4-二羥基苯甲酸酯類化合物，對菜青蟲藥效的預試驗表明，3，4-二羥基苯甲酸酯類隨著疏水鏈的增長，殺蟲能力提高。對蘑菇酪氨酸酶的抑制作用和對小菜蛾(Plutella xylostella L.)的毒效試驗結果表明，3，4-二羥基苯甲酸己酯對酪氨酸酶的IC50為0.9 mmol/L，3，4-二羥基苯甲酸庚酯的IC50為0.26mmol/L；在對小菜蛾的

6、殺蟲毒力上，3，4-二羥基苯甲酸庚酯的毒力倍數(shù)是3，4-二羥基苯甲酸己酯的1.98倍。說明隨著碳鏈的延長，對酶的抑制作用和殺蟲能力都增強，因此可推測3，4-二羥基苯甲酸己酯和3，4-二羥基苯甲酸庚酯抑制了多酚氧化酶的活性，從而影響了小菜蛾幼蟲的蛻皮，使小菜蛾的發(fā)育受阻，進而出現(xiàn)一定的死亡率。3，4-二羥基苯甲酸庚酯與3，4-二羥基苯甲酸己酯相比只是在苯環(huán)的長側鏈延長了一個CH2基團，能更好的與酚氧化酶的結合，加強了對酚氧化酶的抑制作用。

7、
　　 4.PPO(prophenoloxidase)是無活性的酶原，通過蛋白級聯(lián)反應激活形成PO。為了研究多酚氧化酶抑制劑對菜青蟲多酚氧化酶基因表達的影響，我們克隆了來自菜青蟲(鱗翅目：粉蝶科)五齡幼蟲的PPO1和PPO2的cDNA全長序列。PrPPO1的cDNA全長為3307 bp，編碼蛋白由682個氨基酸組成，分子量為78532 Da，PI為6.18；PrPPO2的cDNA全長為2384bp，編碼蛋白由691個氨基酸組成，

8、分子量為79059Da，PI為5.98。PrPPO1和PrPPO2氨基酸序列的生物信息學分析表明：N-末端均缺乏信號肽，含有一個保守的蛋白裂解位點(RF)和一個硫醇脂位點(CGCGWPQ/RHML)。此外，都含有可能的N-糖基化位點，但只有PrPPO2有O-糖基化位點。BLASTp表明PrPPO1的氨基酸序列與其他鱗翅目PPO1氨基酸序列相似性為71-74％；PrPPO2的氨基酸序列與其他鱗翅目PPO2氨基酸序列相似性為70-75％。<

9、br>　　 5.菜青蟲PPO基因主要由PPO1和PPO2兩種基因組成。兩步法RT-PCR能精確而又準確的對基因表達產物進行定量分析，通過相對定量RT-PCR分析PrPPO1和PrPPO2兩個基因在菜青蟲組織中的表達差異性，結果表明：PrPPO1和PrPPO2基因在菜青蟲五齡幼蟲的血淋巴、表皮、中腸和頭中均有表達，兩個基因在血淋巴中的表達量最高，在中腸的表達量最低。系統(tǒng)進化樹表明PrPPO1與小菜蛾的親緣關系最近，PrPPO2與云杉卷葉