菜青蟲(chóng)酚氧化酶原編碼基因的分子克隆及其表達(dá)研究.pdf

1、酚氧化酶(phenoloxidase，EC.1.14.18.1，簡(jiǎn)稱(chēng)PO)是一種重要的酶類(lèi)，廣泛存在于無(wú)脊椎動(dòng)物、脊椎動(dòng)物、植物、細(xì)菌和真菌等生物體內(nèi)，在昆蟲(chóng)變態(tài)發(fā)育和免疫系統(tǒng)中起著重要作用，主要功能可總結(jié)為：
　　 (1)參與表皮的硬化和黑化；
　　 (2)對(duì)卵殼的鞣化作用；
　　 (3)參與傷害防御；
　　 (4)加速傷口的愈合等，是一種潛在的靶標(biāo)酶。
　　 本文通過(guò)RT-PCR和RACE技術(shù)

2、，克隆得到了編碼菜青蟲(chóng)(Pieris rapae)酚氧化酶原的兩個(gè)基因Prophenoloxidase－1(PrPPO1)和Prophenoloxidase-2(PrPPO2)，并對(duì)序列信息進(jìn)行了分析；并通過(guò)Semi-Quantitative RT-PCR和Quantitative Real－time PCR研究了PPO1和PPO2在菜青蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況；并用白僵菌制劑注射菜青蟲(chóng)5齡幼蟲(chóng)，研究白僵菌分生孢子對(duì)菜青蟲(chóng)PPO轉(zhuǎn)錄活性

3、的影響，同時(shí)使用兩種典型的PO抑制劑--槲皮素和曲酸，對(duì)菜青蟲(chóng)5齡幼蟲(chóng)進(jìn)行了處理，測(cè)定了處理后4h、8h和12h時(shí)PPO1的表達(dá)情況。研究結(jié)果如下：
　　 1.PrPPO1全長(zhǎng)cDNA序列有3338bp，包含一個(gè)2049bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)，一個(gè)63bp的5’非編碼區(qū)(5’UTR)和一個(gè)1226bp的帶有加尾信號(hào)的3’非編碼區(qū)(3’UTR)。開(kāi)放閱讀框從第64個(gè)核苷酸開(kāi)始，終止于第2102個(gè)核苷酸，由其推導(dǎo)的氨基酸序列以甲

4、硫氨酸為起始氨基酸，長(zhǎng)為682個(gè)氨基酸，分子量為78.57kDa，估測(cè)等電點(diǎn)pI為6.37。
　　 2.PrPPO2部分cDNA序列有1679bp，包含一個(gè)1173bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)和一個(gè)506bp的帶有加尾信號(hào)的3’非編碼區(qū)(3’UTR)。開(kāi)放閱讀框從第1個(gè)核苷酸開(kāi)始，終止于第1173個(gè)核苷酸，由于該片段為部分cDNA，其他相關(guān)參數(shù)不做預(yù)測(cè)。
　　 3.PrPPO1基因的氨基酸序列與其它鱗翅目昆蟲(chóng)PPO1基因具

5、有較高的同源性(69.73％～73.15％)；PrPPO2基因的氨基酸序列與其它鱗翅目昆蟲(chóng)PPO2基因具有較高的同源性(70.0％～72.0％)。
　　 4.PrPPO1和PrPPO2各均具有兩個(gè)高度保守的銅離子結(jié)合位點(diǎn)，及位于銅離子結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的6個(gè)保守的組氨酸殘基，此外，PrPPO1還包含一個(gè)類(lèi)似于脊椎動(dòng)物的α-巨球蛋白的硫羥酸酯區(qū)域。PrPPO1與PrPPO2的N端均不含信號(hào)肽，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。
　　 5.PrPP

6、O1中，α-螺旋占17.16％，隨機(jī)卷曲63.20％，它們是PrPPO1最大量的結(jié)構(gòu)元件，延伸鏈占19.65％，散布在整個(gè)蛋白質(zhì)中，無(wú)β轉(zhuǎn)角存在，同源建模顯示PrPPO1三級(jí)結(jié)構(gòu)均為“α/β型”中的“滾筒結(jié)構(gòu)”。
　　 6.PrPPO1在成蟲(chóng)中的表達(dá)量設(shè)定為1.0,PrPPO1在卵和4齡幼蟲(chóng)中表達(dá)量最高，表達(dá)量分別為2.76和5.60；PrPPO1在5齡幼蟲(chóng)和蛹中表達(dá)量較低，為0.21和0.26；在1齡、2齡、3齡幼蟲(chóng)中，PrP

7、PO1的表達(dá)量比較接近，分別為2.16、1.82和1.52。PrPPO2在成蟲(chóng)中的表達(dá)量設(shè)定為1.0,PrPPO2在4齡幼蟲(chóng)中表達(dá)量最高，表達(dá)量為13.24；卵和3齡幼蟲(chóng)次之；PrPPO2在5齡幼蟲(chóng)中表達(dá)量較低，為0.96；在1齡和2齡幼蟲(chóng)中，PrPPO1的表達(dá)量比較接近，分別為2.98和2.65；預(yù)蛹和蛹比較接近，分別為1.91和1.42。通過(guò)Real-timePCR和RT-PCR比較PrPPO表達(dá)量變化結(jié)果非常相近。