新型單克隆抗體熒光探針染料的合成及免疫熒光組織化學(xué)應(yīng)用.pdf

1、熒光探針在分子生物學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)、分析化學(xué)、化工和醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域有著廣泛地應(yīng)用。同時(shí)它的發(fā)展與生命科學(xué)、化學(xué)、生物技術(shù)、診斷醫(yī)學(xué)等學(xué)科緊密相關(guān)。隨著相關(guān)技術(shù)的發(fā)展與普及，熒光探針的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，與此同時(shí)對(duì)熒光探針染料性能的要求也越來(lái)越高。熒光探針染料的合成與應(yīng)用研究已發(fā)展成為生命科學(xué)和化學(xué)交叉的前沿研究領(lǐng)域。 熒光素具有高的消光系數(shù)，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)都在可見光區(qū)，在水中具有較高的熒光量子產(chǎn)率，且無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)。另外還可以通過(guò)

2、對(duì)母體的修飾滿足不同使用條件(例如：最大吸收波長(zhǎng)，最大發(fā)射波長(zhǎng)，高的熒光量子產(chǎn)率等)的需要。所以該類熒光探針染料已廣泛的應(yīng)用于生物活體內(nèi)DNA的檢測(cè)和蛋白質(zhì)標(biāo)記復(fù)雜生物體系的研究等領(lǐng)域。 本論文圍繞新型熒光素基單克隆抗體熒光探針染料的設(shè)計(jì)、合成及免疫熒光組織化學(xué)應(yīng)用展開，主要內(nèi)容有以下幾個(gè)方面。 1.對(duì)熒光素前體2，5-二氯對(duì)二甲苯的合成條件進(jìn)行了優(yōu)化。提出一種未見文獻(xiàn)報(bào)道制備2-5-二氯對(duì)二甲苯的新方法一微波促進(jìn)合成法

3、，并對(duì)其合成條件進(jìn)行了研究。對(duì)熒光素中間體3，6.二氯-1，2-4-苯三酸酐合成進(jìn)行了研究，并對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道方法進(jìn)行了優(yōu)化改進(jìn)。 2.設(shè)計(jì)并合成了2種未見文獻(xiàn)報(bào)道的熒光素類化合物4，7，4'，5'.四氯-5-羧基熒光素和4，7，4'，5'-四氯-6-羧基熒光素。對(duì)5(6）-羧基氯代熒光素的合成條件進(jìn)行了優(yōu)化，并提出了一種有效的異構(gòu)體混合物的分離方法，混和物經(jīng)酯化、成鹽、重結(jié)晶，成功地進(jìn)行了分離。對(duì)所有異構(gòu)體結(jié)構(gòu)都進(jìn)行了表征。

4、 3.合成了4，7，2'，7'.四氯.5(6)-羧基熒光素并對(duì)5(6)-羧基異構(gòu)體成功地進(jìn)行了分離，首次報(bào)道了的4，7，2'，7'-四氯-5.羧基熒光素新戊酸酯的晶體結(jié)構(gòu)。 4.合成了4種具有空間連接鏈的熒光素基單克隆抗體DNA熒光探針染料，其中2種未見文獻(xiàn)報(bào)道，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。 5.合成了4種未見文獻(xiàn)報(bào)道的具有空間連接鏈的新型熒光素基單克隆抗體蛋白熒光標(biāo)記探針染料，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。 6.分別用新型單

5、克隆抗體熒光探針染料TET2477 acid及TET4457 acid對(duì)抗生蛋白鏈菌素單克隆抗體(免疫球蛋白G，IgG)進(jìn)行標(biāo)記，制備了單克隆抗體熒光探針。經(jīng)過(guò)測(cè)定兩種熒光探針染料對(duì)抗體的取代度均在2～4之間，標(biāo)記有效，取代度適中。用該單克隆熒光探針進(jìn)行免疫反應(yīng)，利用共聚焦熒光顯微成像技術(shù)得到了牛肺部動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞 - 微管蛋白及牛肺部?jī)?nèi)皮細(xì)胞肌動(dòng)蛋白標(biāo)記細(xì)胞圖像。對(duì)U20S(人體骨肉瘤上皮細(xì)胞)，Hela(人宮頸癌上皮細(xì)胞)用直接法進(jìn)行