豬SIM1、PPARγ2和UCP3基因分子特性及遺傳效應(yīng)研究.pdf

1、利用RT-PCR和RACE技術(shù)，以金華豬下丘腦cDNA為模板擴(kuò)增、克隆豬SIM1基因全長(zhǎng)cDNA序列，得到3714 bp的cDNA序列。其中包括一個(gè)2301 bp的開放閱讀框461 bp的5’非翻譯區(qū)和952 bp的3’非翻譯區(qū)。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)SIM1基因序列、編碼蛋白結(jié)構(gòu)、功能等特征進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。結(jié)果表明：豬SIM1全長(zhǎng)cDNA序列與牛、人、黑猩猩、獼猴的同源性分別達(dá)到92.8％，94.5％，91.4％和94.4％。豬SIM1

2、基因具有bHLH-PAS家族完整保守結(jié)構(gòu)域，而且結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化中高度保守。pSIM1起源上和牛具有較近的親緣關(guān)系。
　　 應(yīng)用real-time PCR方法研究SIM1基因的mRNA表達(dá)譜及在脂肪組織的發(fā)育表達(dá)規(guī)律。結(jié)果表明，SIM1基因在檢測(cè)的十個(gè)組織內(nèi)均有表達(dá)，其中在腎臟表達(dá)量最高，肌肉次之，脂肪組織的表達(dá)量最低。在金華豬和大約克脂肪組織不同生長(zhǎng)階段的發(fā)育表達(dá)發(fā)現(xiàn)，SIM1基因在20d-120d日齡表達(dá)量持續(xù)增長(zhǎng)，在150d后

3、表達(dá)量下降，但不同日齡之間表達(dá)量差異不顯著。SIM1基因在大約克所有生長(zhǎng)階段的脂肪組織內(nèi)表達(dá)量均高于金華豬。
　　 應(yīng)用Western blot技術(shù)研究SIM1蛋白的組織表達(dá)譜和在肌肉組織的發(fā)育表達(dá)規(guī)律。結(jié)果表明：SIM1蛋白在7個(gè)待檢組織內(nèi)都檢測(cè)到。其中大腦和下丘腦的表達(dá)量最高，在皮脂內(nèi)的表達(dá)最低，表達(dá)模式和mRNA水平檢測(cè)相似。在金華豬不同生長(zhǎng)階段的肌肉組織內(nèi)的發(fā)育表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，SIM1蛋白僅在20d和45d有微量表達(dá)，之后

4、的階段幾乎沒有表達(dá)。在大約克豬肌肉組織內(nèi)進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：SIM1蛋白在大約克不同生長(zhǎng)階段均有表達(dá)，在90d和120d表達(dá)量最高，150d后表達(dá)量逐漸減少。金華豬的背膘厚和肌內(nèi)脂肪含量顯著高于大約克，推測(cè)SIM1的表達(dá)量和脂肪性狀值呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，而且SIM1可能通過參與Leptin-Melanocortin-Oxytocin途徑調(diào)控飲食和能量代謝，進(jìn)而導(dǎo)致脂肪代謝改變。本試驗(yàn)新發(fā)現(xiàn)SIM1基因SNPs包括C534T。和T1677C位

5、點(diǎn)。應(yīng)用PCR-SSCP技術(shù)，分析兩處多態(tài)位點(diǎn)在國(guó)內(nèi)外豬種的分布，結(jié)果表明在C534T位點(diǎn)，國(guó)內(nèi)豬種的C等位基因頻率高于國(guó)外豬種，在T1677C位點(diǎn)，只有TT基因型存在于外國(guó)豬種內(nèi)。在PJF2代群體內(nèi)進(jìn)行遺傳效應(yīng)分析，發(fā)現(xiàn)C534T突變位點(diǎn)基因型與BFT、IMF、IMW和后腿肌肉重極顯著相關(guān)(p<0.01)，和后腿脂肪重顯著相關(guān)(p<0.05)。等位基因T攜帶個(gè)體有較高的脂肪含量和后腿肌肉重。T1677C座位和BFT、后腿溫度、后腿脂肪

6、重極顯著相關(guān)(p<0.01)，和LEA、后腿pH、后腿肌肉重顯著相關(guān)(p<0.05)。等位基因T可顯著降低肌內(nèi)脂肪含量，同時(shí)提高后腿肌肉重和LEA。
　　 擴(kuò)增金華豬和皮特蘭豬的PPARγ2基因全部外顯子，結(jié)合PCR-SSCP技術(shù)和測(cè)序技術(shù)比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)A175G(位于Exon1)和G876A(位于Exon5)突變位點(diǎn)。在8個(gè)國(guó)內(nèi)外豬種內(nèi)分析SNPs的多態(tài)性分布，發(fā)現(xiàn)在A175G位點(diǎn)，A等位基因頻率在外國(guó)豬種較高(>75％)，而

7、在國(guó)內(nèi)豬種內(nèi)稍低(<67％)。在G876A位點(diǎn)，只在金華豬內(nèi)發(fā)現(xiàn)等位基因A的存在，其他品種內(nèi)均只有GG型，推測(cè)等位基因A為金華豬特有。A175G和G876A在PJF2資源群體處于連鎖不平衡狀態(tài)，利用單倍型方法分析基因?qū)χ拘誀畹倪z傳效應(yīng)，結(jié)果表明：PPARγ2基因單倍型和肩部BFT、腰薦結(jié)合部BFT顯著相關(guān)(p<0.05)，同時(shí)單倍型和6-7th肋BFT、最后一根肋骨處BFT、后腿重極顯著相關(guān)(p<0.01)。H1H3單倍型個(gè)體有較低的

8、后腿重(p<0.01)。H2H3單倍型個(gè)體的6-7th肋BFT、最后一根肋骨BFT和腰薦結(jié)合部BFT相比其他單倍型個(gè)體高(p<0.01)，肩部BFT以H1H3單倍型個(gè)體最高，H2H3次之。由此可知，PPARγ2基因是豬背膘厚脂肪性狀候選基因。
　　 擴(kuò)增比對(duì)金華豬和皮特蘭豬UCP3基因cDNA序列，發(fā)現(xiàn)兩處SNPs：T211C和A448G。利用PCR-RFLP技術(shù)分析SNPs在8個(gè)國(guó)內(nèi)外豬種內(nèi)的多態(tài)分布，發(fā)現(xiàn)在T221C位點(diǎn)，所

9、有國(guó)內(nèi)品種內(nèi)只發(fā)現(xiàn)CC基因型，等位基因T存在于國(guó)外豬種內(nèi)。A448G位點(diǎn)，等位基因G在除皮特蘭豬外的所有豬種內(nèi)都有較高的頻率。嵊縣花豬在這兩個(gè)位點(diǎn)都純合，在T221C突變位點(diǎn)為CC基因型，在A448G突變位點(diǎn)為GG基因型。在PJF2代資源群體內(nèi)的遺傳效應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)，T221C位點(diǎn)對(duì)脂肪性狀沒有顯著地遺傳效應(yīng)。A448G位點(diǎn)基因型和IMW、IMF以及LEA極顯著相關(guān)(p<0.01)?；蛐秃秃笸萷H值相關(guān)性也接近顯著，GG基因型個(gè)體的肩部B