γ-干擾素介導牛結核快速檢測方法的研究及初步應用.pdf

1、牛結核病是由牛分枝桿菌所引起的一種人畜共患的慢性消耗性傳染病，人可因感染牛分枝桿菌而發(fā)生結核[1,2,3]，因此牛結核病不僅關系到畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展，而且直接影響人類的健康[4，5]。國際上普遍采取“檢疫-撲殺”的措施控制該病的傳播。盡管有關牛結核檢測方法有多種，但快速、靈敏、特異的方法在我國還沒有建立，因此本研究通過研制的抗牛γ-干擾素單克隆抗體建立了牛IFN-γ競爭抑制ELISA方法和膠體金免疫層析檢測牛結核IFN-γ方法。初步臨床應

2、用顯示ELISA方法對臨床奶牛樣本IFN-γ的檢測結果與結核菌素皮膚試驗(Tuberculin Skin Test,TST)結果符合率為83.4％；膠體金免疫層析檢測結果與TST結果符合率為78.6％，膠體金免疫層析檢測結果與進口試劑盒結果的符合率為85.7％，進口試劑盒檢測結果與TST檢測結果符合率為78.6％。此結果為進一步研究開發(fā)特異性和敏感性更高的牛IFN-γ的檢測方法奠定了基礎，為我國牛結核病的防控提供了一種比較簡便的檢測手段

3、。
　　 ㈠抗BoIFN-γ特異性單克隆抗體的研制及鑒定。
　　 利用大腸桿菌表達融合蛋白GST-BoIFN-γ的細菌裂解上清作為抗原免疫BALB/C小鼠，取其脾細胞與SP2/0細胞進行融合，以表達GST-BoIFN-γ的大腸桿菌超聲波裂解物和表達GST的大腸桿菌超聲波裂解物分別作為包被抗原，通過間接ELISA方法平行篩選獲得了3株抗BoIFN-γ的單克隆抗體，分別命名為BoIFN-γ-5G7、BoIFN-γ-6G7和B

4、oIFN-γ-6D11。Western-blot試驗證實，本研究所獲得的單克隆抗體均能與表達GST-BoIFN-γ融合蛋白的重組菌反應，識別分子量為42kD特異性蛋白質條帶，與表達GST的非重組菌不反應；間接免疫熒光試驗(IFA)結果證實，單抗能特異性識別Sf9細胞表達的重組BoIFN-γ，在熒光倒置顯微鏡下可見亮綠色熒光。捕獲ELISA方法進行亞類鑒定結果表明，單抗6G7和5G7為IgG2a亞類，單抗6D11為IgM亞類。5G7單抗腹

5、水的效價可以達到1∶409600，細胞上清效價可達到1∶20000，6G7單抗腹水和細胞上清的效價分別為1∶204800和1∶4000，6D11單抗腹水和細胞上清的效價分別為1∶12800和1∶2560。中和試驗結果表明，單抗6G7對大腸桿菌表達的rBoIFN-γ和桿狀病毒真核表達系統(tǒng)表達的rBoIFN-γ具有一定的中和作用。本研究所獲得的三株單抗為建立檢測BoIFN-γ的方法提供了條件。
　　 ㈡競爭抑制ELISA檢測BoIF

6、N-γ方法的建立及初步應用。
　　 用GST瓊脂糖凝膠FF柱純化大腸桿菌表達的重組GST-BoIFN-γ，按不同濃度梯度包被ELISA酶標板，篩選最佳抗原包被濃度；用Hi-Trip Protein G柱純化單克隆抗體BoIFN-γ-6G7，測定最小飽和抗體量；然后將待檢樣品與定量的單克隆抗體BoIFN-γ-6G7作用后加入到包被抗原的ELISA酶標板上，37℃濕盒進行競爭反應，再與1∶10000稀釋的HRP標記兔抗鼠酶標抗體作用

7、并以底物顯色，建立了一種有效檢測奶牛天然IFN-γ競爭抑制ELISA方法。
　　 用建立的該方法檢測北京臨床樣品23份和江蘇某奶牛場樣品30份，結果表明，北京樣品全部為陽性，與進口試劑盒檢測結果完全一致。江蘇某奶牛場30份樣品中有8份陽性，3份可疑，其余為陰性，檢測結果與結核菌素皮內試驗符合率為83.4％。
　　 ㈢膠體金免疫層析檢測BoIFN-γ方法的建立及初步應用。
　　 以檸檬酸三鈉法制備直徑為30nm左右

8、的膠體金溶液，調節(jié)pH值至8.3；以3.3μg/ml的單抗BoIFN-γ-6G7標記膠體金，用10％BSA和10％PEG-20000穩(wěn)定膠體金溶液；離心后用PB稀釋液稀釋金標復合物，噴玻璃纖維素膜；NC膜上分別以0.6μl/cm和0.8μl/cm的量噴C、T線，組裝試紙條。
　　 用試紙條對江蘇某奶牛場14份血樣進行檢測，結果7份陽性，3份可疑，4份陰性，與結核菌素皮膚試驗(TST)符合率為78.6％，試紙條檢測結果與進口試劑盒