運動發(fā)酵單胞菌工程菌株的構(gòu)建及發(fā)酵的初步研究.pdf

1、20世紀,科學(xué)家利用石油作為主要能源及石油化學(xué)品的原料,為人類社會發(fā)展做出了巨大的貢獻。但隨之也出現(xiàn)了兩個嚴重的問題:一是石油為不可再生的資源。二是用石油作為燃料及化學(xué)品原料使環(huán)境遭到嚴重破壞,特別是CO2的溫室效應(yīng)。隨著人們對全球性能源危機認識的不斷加深及環(huán)境保護意識的不斷加強,研究與尋找環(huán)境友好的石油能源的替代品成為世界技術(shù)開發(fā)的方向之一。從20世紀70年代中期開始,利用生物技術(shù)和可再生資源(生物源)進行乙醇的工業(yè)化生產(chǎn),并以此作為

2、石油能源的替代物成為各國的研究熱點。
　　 運動發(fā)酵單胞菌是極具開發(fā)潛力的乙醇生產(chǎn)菌種,與傳統(tǒng)的發(fā)酵乙醇的微生物如釀酒酵母相比,運動發(fā)酵單胞菌具有很多優(yōu)點,但其可利用的底物僅為葡萄糖、果糖和蔗糖。為了開發(fā)利用運動發(fā)酵單胞菌卓越的產(chǎn)乙醇能力,應(yīng)用基因工程手段擴大運動發(fā)酵單胞菌的底物范圍,使其能夠同時利用淀粉與纖維素生產(chǎn)乙醇,是實驗的最終目的。
　　 本研究首先提取Z.mobilis ATCC31821總基因組DNA,進行引

3、物設(shè)計(Jeong-Sun Seo et al.2005,GenBank Accession008692.2),從細菌中克隆出丙酮酸脫羧酶(pdc)啟動子pdc。以酵母表達載體pPIC9K為模板,進行引物設(shè)計(Scorer,C.A..1994,GenBank:Z46234.1),用PCR的方法克隆出一段約為270bp的片段,即信號肽α-mating factor。提取瑞氏木霉總RNA,做RT-PCR,克隆出內(nèi)切葡聚糖酶基因。提取泡盛曲霉

4、總RNA,做RT-PCR,克隆出葡萄糖淀粉酶基因。
　　 將啟動子pdc,信號肽,內(nèi)切葡聚糖酶基因和葡萄糖淀粉酶基因克隆到pBBR1-MCS2表達載體上,構(gòu)建了兩個單價載體pBPSG,pBPSE和一個雙價載體pBPSGE。將這三個表達載體分別轉(zhuǎn)Z.mobilis ATCC31821,得到重組菌Z.mobilisATCC31821(pBPSG),Z.mobilis ATCC31821(pBPSE)和Z.mobilis ATCC31

5、821(pBPSGE)。30℃培養(yǎng),測其酶活分別為0.94U/ml、0.76U/ml、1.57U/ml,Z.mobilis、Zmobilis(pBBR1-MCS2)沒有檢測到酶活性。
　　 用Z.mobilis、Z.mobilis(pBBR1-MCS2)、Z.mobilis ATCC31821(pBPSG),Z.mobilis ATCC31821(pBPSE)和Z.mobilis ATCC31821(pBPSGE)發(fā)酵木薯粉。4

6、8h后運動發(fā)酵單胞菌的酒精產(chǎn)率達到最大值,Z.mobilis ATCC31821產(chǎn)量9.05°,Z.mobilis ATCC31821(pBBR1-MCS2)產(chǎn)量9.02°,Z.mobilis ATCC31821(pBPSG)產(chǎn)量9.34°,Z.mobilis ATCC31821(pBPSE)產(chǎn)量9.46°,Z.mobilis ATCC31821(pBPGE)產(chǎn)量9.71°。由結(jié)果可見,重組菌酒精產(chǎn)量明顯比野生菌高。
　　 本研