糖多孢紅霉菌WB菌株及相關(guān)基因工程菌發(fā)酵工程研究.pdf

1、糖多孢紅霉菌是工業(yè)上生產(chǎn)紅霉素的放線菌，紅霉素是臨床上被廣泛用于治療革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌感染的廣譜14-元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，近年來紅霉素產(chǎn)業(yè)在我國(guó)發(fā)展迅速，紅霉素產(chǎn)量的提升和組分的改善主要取決于菌種自身的發(fā)酵能力、發(fā)酵工藝和發(fā)酵罐的工作能力。伴隨著紅霉素市場(chǎng)需求的日益增加，紅霉素高產(chǎn)菌株篩選的步伐也在不斷加快?；蚬こ谈脑旌Y選高產(chǎn)菌株是一種簡(jiǎn)捷的操作手段。TetR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(TetR family transcriptional reg

2、ulator, TFR)是最常見的原核轉(zhuǎn)錄調(diào)控家族之一，以其家族中結(jié)構(gòu)和功能研究最為清楚的成員-四環(huán)素抗性阻遏蛋白(TeR Repressor, TetR)而命名。SACE3446基因是糖多孢紅霉菌中普遍存在的可負(fù)調(diào)控紅霉素生物合成的基因，而SACE_7301是糖多孢紅霉菌中TetR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，其正調(diào)控紅霉素產(chǎn)量，即它是一個(gè)正調(diào)控基因。
　　本研究以糖多孢紅霉菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物紅霉素為研究對(duì)象，利用實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建并篩選獲得的高產(chǎn)

3、基因工程菌株，通過搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)研究了其生產(chǎn)能力。采用5L小試發(fā)酵罐為主培養(yǎng)方法，分析驗(yàn)證了各種因素如:溫度、pH值、攪拌槳層數(shù)、轉(zhuǎn)速、接種量、種子齡等對(duì)糖多孢紅霉菌WB菌株小試發(fā)酵過程中生長(zhǎng)代謝的影響，利用以上單因素實(shí)驗(yàn)確定選取溫度、接種量、種子齡三個(gè)因素做Box-Benhnken設(shè)計(jì)，且在Box-Benhnken設(shè)計(jì)中，溫度、接種量、種子齡的選取范圍也可以確定，以此做響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，進(jìn)一步確定了上述三個(gè)因素的范圍。最終總結(jié)出一套較適合

4、糖多孢紅霉菌WB菌株的小試發(fā)酵工藝，并利用該工藝對(duì)基因工程菌株WB/3446和WB/3*7301進(jìn)行小試發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，總結(jié)了基因工程菌株與原始菌株小試發(fā)酵的異同，驗(yàn)證了基因工程菌株的生產(chǎn)能力。通過以上研究獲得以下結(jié)果:基因工程菌株WB/3446和WB/3*7301搖瓶效價(jià)分別為973mg/L和862mg/L，較原始菌株WB分別提高了39.8％和33.6％。通過小試發(fā)酵實(shí)驗(yàn)分別確定了5L發(fā)酵罐的小試發(fā)酵工藝條件為:溫度30℃、pH值7.0-7

5、.2、攪拌槳2層、攪拌轉(zhuǎn)速350 rpm、接種量20％、種子齡50 h左右、葡萄糖平均補(bǔ)入速率0.0076 g/min;響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得出，溫度31℃、接種量19.5％、種子齡49.5 h條件下WB菌株發(fā)酵水平為3210mg/L，且三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了該結(jié)論的準(zhǔn)確性。通過利用上述小試發(fā)酵工藝進(jìn)行基因工程菌株小試發(fā)酵實(shí)驗(yàn)得出結(jié)果:WB/3446的紅霉素A產(chǎn)量為4383 mg/L較原始菌株WB提高了35.1％，且基因工程菌株WB/3446菌

6、絲體生長(zhǎng)較WB菌株稍快，糖消耗量大，葡萄糖平均補(bǔ)加速率為0.0092 g/min，而WB菌株為0.0076 g/min?；蚬こ叹闣B/3*7301小試發(fā)酵結(jié)果得出紅霉素A產(chǎn)量為4177mg/L相對(duì)于WB菌株提高了34.6％，且其菌絲體量在發(fā)酵的前期和WB菌株無明顯差異，而在發(fā)酵的中后期基因工程菌WB/3*7301菌濃始終高于WB菌株，在發(fā)酵過程中還發(fā)現(xiàn)WB/3*7301菌株的糖消耗量始終高于WB菌株，其葡萄糖平均補(bǔ)入速率為0.009