水稻紋枯病菌菌核形成過(guò)程中特異基因的表達(dá)與分析.pdf

1、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)是一類十分重要的植物病原真菌,寄主范圍廣泛,可引起包括水稻、小麥、玉米等重要作物在內(nèi)的多種作物菌核病的發(fā)生,危害十分嚴(yán)重。而關(guān)于水稻紋枯病致病病原菌菌核的形成和發(fā)育機(jī)理,目前國(guó)內(nèi)外研究已經(jīng)有較多報(bào)道,但主要集中于營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境因子等對(duì)菌核形成的影響,而在菌核形成的分子生物學(xué)研究方面,盡管有了一些有益的探索,但至今仍缺乏深入的研究。許多與立枯絲核菌菌核形成的相關(guān)基因有待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。

2、　　 本項(xiàng)目采用抑制消減雜交方法(Suppression Subtractive Hybridization,以下簡(jiǎn)稱SSH)結(jié)合虛擬Northern篩選方法(virtual Northern)構(gòu)建了水稻紋枯病菌菌核形成過(guò)程誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生的差減cDNA文庫(kù),分離并克隆出菌核形成相關(guān)基因,從基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平探討菌核形成機(jī)理,以期為水稻紋枯病防治提供理論基礎(chǔ)。項(xiàng)目以GD-118菌株菌絲形成期材料mRNA為驅(qū)動(dòng)子(driver),以菌核形成期

3、mRNA為檢測(cè)子(Tester),分別提取材料總RNA,分離mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,經(jīng)Rsa-I酶切,連接不同接頭后進(jìn)行連續(xù)兩次消減雜交和兩次PCR反應(yīng)以獲得差異表達(dá)基因片段。將PCR產(chǎn)物與T載體連接并轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,通過(guò)藍(lán)白斑篩選獲得重組克隆,構(gòu)建紋枯病原菌菌核特異性表達(dá)cDNA文庫(kù)。從庫(kù)中隨機(jī)篩選145個(gè)白色菌落經(jīng)PCR鑒定其中有112個(gè)克隆有目的基因片段插入,且插入片段大小主要分布在200-500bp之間。挑取

4、陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序,所得序列利用DNAMAN軟件去除載體及接頭序列,剔除重復(fù)序列,獲得部分差異表達(dá)ESTs。對(duì)所獲得的ESTs繼續(xù)應(yīng)用Virtual Northem雜交篩選,以菌絲、菌核cDNA序列為探針進(jìn)行驗(yàn)證。將經(jīng)過(guò)驗(yàn)證差異表達(dá)明顯的序列做進(jìn)一步同源性比對(duì)并分析相關(guān)序列的表達(dá)結(jié)果,獲得了菌核形成相關(guān)的28條特異表達(dá)基因片段,其中有16條序列在GeneBank上較高同源性序列,主要涉及脅迫響應(yīng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)、合成代謝等,其中另有1