水稻紋枯病菌致病因子及寄主Ospgip1基因克隆與遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、水稻紋枯病菌在致病過(guò)程中可以產(chǎn)生毒素、胞壁降解酶和黑色素等致病因子，而寄主為了阻止病菌的侵入與擴(kuò)展，亦可編碼相應(yīng)分解或抑制這些致病因子的抗性物質(zhì)，本研究對(duì)病菌的致病因子與寄主相關(guān)抗性基因進(jìn)行了初步研究，擬為進(jìn)一步進(jìn)行病原物與寄主互作研究打下基礎(chǔ)。
　　 為建立可靠的水稻紋枯病苗期抗性鑒別體系，經(jīng)多年研究，從數(shù)百份水稻種質(zhì)中篩選出68個(gè)品種（系）進(jìn)行連續(xù)兩年的田間接種試驗(yàn)，從中選出抗性分別為抗、中抗、中感、感和高感的品種YSBR1

2、、C418、Jasmine85、武育粳3號(hào)和Lemont作為鑒別品種。從海南、福建、云南、廣西、廣東、湖南和江蘇等地?cái)?shù)百株菌株中篩選出30個(gè)菌株進(jìn)行苗期致病力測(cè)定，從中選出致病力分別為強(qiáng)、中、弱的菌株C30、E67和YN-3作為鑒別菌株。為了與以前研究結(jié)果相聯(lián)系，增補(bǔ)了致病力處于C30與E67之間的華南農(nóng)業(yè)大學(xué)常用菌株GD118和揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院常用菌株YN-7作為鑒別菌株。初步建立了一套具5個(gè)鑒別寄主和5個(gè)鑒別菌株的苗期抗性鑒定體系，將

3、中選品種與菌株進(jìn)行大田驗(yàn)證，結(jié)果與苗期趨勢(shì)一致。利用該體系對(duì)江蘇省90個(gè)水稻紋枯病菌菌株致病力分化進(jìn)行了初步研究，動(dòng)態(tài)聚類表明，可將之明確分為致病力強(qiáng)、中、弱三類，這與多數(shù)前人的研究具有一致性。
　　 毒素作為水稻紋枯病菌致病因子，在致病過(guò)程中起重要作用，菌株產(chǎn)生毒素的能力與其致病力呈顯著正相關(guān)，但對(duì)其毒素的本質(zhì)一直未有定論。本文比較了前人的研究方法，結(jié)果表明，不同提取方法所得產(chǎn)物具有相同的紫外吸收峰，萃取用有機(jī)溶劑以乙醚為最佳

4、。通過(guò)兩次SephadexG-75柱層析，將純化的精毒素通過(guò)HPLC、TLC、IR和GL-MS分析表明，該毒素的主要成分為碳水化合物，包括葡萄糖、N-乙酰氨基甘露糖以及蔗糖等。穩(wěn)定性分析表明，該毒素對(duì)長(zhǎng)時(shí)間光照、高溫、強(qiáng)酸或強(qiáng)堿、強(qiáng)氧化性的化合物等都不穩(wěn)定。利用毒素對(duì)水稻胚根伸長(zhǎng)的抑制、細(xì)胞膜的破壞作用可很好的區(qū)分品種的抗感性，但對(duì)不同品種幼苗的致萎時(shí)間卻與品種抗性無(wú)關(guān)。
　　 胞壁降解酶是水稻紋枯病菌另一個(gè)重要致病因子，在眾多

5、胞壁降解酶中以多聚半乳糖醛酸酶(PG)的活性最高。實(shí)驗(yàn)條件下，紋枯病菌PG的產(chǎn)生受培養(yǎng)時(shí)間、溫度、振蕩條件、C源、葡萄糖濃度及培養(yǎng)液pH的影響，而活性受緩沖液pH和溫度的調(diào)控。以葡萄糖為最適碳源，但在高濃度葡萄糖（≥5％）條件下，PG的產(chǎn)生受到抑制;在50℃，緩沖液pH5的條件下，PG活性最高。通過(guò)丙酮沉淀和DEAESepharoseFastFlow離子交換柱、Phenyl-Sepharose6FastFlow疏水柱、SephadexG

6、-75凝膠柱和DE52離子交換柱層析，得到一分子量為39.81kD、等電點(diǎn)4.58、含糖量為1.48％的純蛋白，該純蛋白不含脂和芳香族氨基酸。
　　 據(jù)GenBank和相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增Rspgl基因，獲得一長(zhǎng)1395bp的完整開(kāi)放閱讀框。RT-PCR分析表明，該基因含有5個(gè)內(nèi)含子(278～334，57bp;545～601，57bp;657～715，59bp;1090～1155，66bp;1244～1304，61bp)，編碼區(qū)

7、為1095bp，翻譯成含有364個(gè)氨基酸的RsPG1。生物信息學(xué)分析表明，RsPG1中含有所有生物PGs特有的嚴(yán)格保計(jì)序列180NTD、202DD、223GHG和255RIK，存在一18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽分子;二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋、β-折疊和隨機(jī)卷曲為其基本結(jié)構(gòu)單元，6個(gè)半胱氨酸殘基形成3個(gè)二硫鍵，跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)以從胞內(nèi)向胞外分泌為主;三級(jí)結(jié)構(gòu)為10個(gè)重復(fù)的β-折疊環(huán)按右手螺旋規(guī)則排列形成的螺旋結(jié)構(gòu)，含有一個(gè)開(kāi)放的有活性的裂隙結(jié)構(gòu)，3D預(yù)測(cè)圖

8、除少數(shù)幾個(gè)位點(diǎn)與FmPG有細(xì)微差異外，其它結(jié)構(gòu)基本完全一致。
　　 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是植物細(xì)胞壁上能特異性識(shí)別和結(jié)合真菌PGs并抑制其活性的蛋白，它能促進(jìn)植物體內(nèi)具有激發(fā)子活性的寡聚糖的積累，激發(fā)防衛(wèi)機(jī)制和調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而提高和延長(zhǎng)植物的抗性反應(yīng)，在植物抗病過(guò)程中起重要作用。水稻中存在四個(gè)OsPGIP分子，其中OsPGIP1對(duì)植物病原真菌PG有較好的抑制作用。據(jù)GenBank和相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增獲得一長(zhǎng)

9、930bp的完整開(kāi)放閱讀框。編碼產(chǎn)物生物信息學(xué)分析表明，OsPGIP1由309個(gè)氨基酸組成，存在一17個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，含有9個(gè)LRR重復(fù)，與其它植物PGIP相比，其第7個(gè)LRR重復(fù)缺失;二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋、β-折疊和不規(guī)則盤繞為結(jié)構(gòu)元件，不存在卷曲螺旋，8個(gè)半胱氨酸殘基可形成3個(gè)二硫鍵，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)存在;三級(jí)結(jié)構(gòu)LRR區(qū)以9個(gè)α-螺旋和9個(gè)β-折疊將整個(gè)蛋白組裝成一個(gè)具有較大裂隙的空間結(jié)構(gòu)，該裂隙區(qū)負(fù)責(zé)著蛋白質(zhì)與植物病原真菌PG互作