陸地棉體細胞胚分化過程中特異表達基因的研究.pdf

1、棉花體細胞胚胎發(fā)生的研究對于促進棉花遺傳工程改良具有極其重要的意義，但是對于陸地棉體細胞胚胎發(fā)生過程的分子機制研究仍然較少。 本研究以中棉所24篩選出的高分化率株系W10為材料，以培養(yǎng)35天的愈傷組織cDNA為driver，胚性愈傷組織出現(xiàn)后1、2、3、4、5、6、7、14、21天的混合cDNA為tester，構建了抑制性消減文庫。經(jīng)驗證胚性愈傷組織中差異表達的基因片段得到了約20倍的富集，文庫滴度為1×104pfu/ml，重組

2、率99％。經(jīng)過反向Northern篩選，得到368個差異表達的ESTs，代表了254個非冗余基因。分析表明，消減文庫中含有一些參與棉花體細胞胚胎發(fā)生的新基因。從非冗余基因中選擇了8個基因，RT-PCR結果表明這些基因在不同時間的胚性愈傷組織中均表現(xiàn)出不同程度的上調(diào)。以再分化培養(yǎng)基(MSB培養(yǎng)基中添加0.1mg/LIAA及0.1mg/LKT)和未添加任何激素的空白對照培養(yǎng)基，取第15天和第30天的愈傷組織，以等量混合的dscDNA標記探針

3、。經(jīng)過反向Northern篩選，共得到220個激素應答克隆，對應117個非冗余基因。隨后利用SSRIT軟件在254個非冗余基因中找到了19條可用于分子標記的具有簡單重復序列的EST，在親本組配為TM-1×W10的F2群體中驗證，其中4對引物具有多態(tài)性。利用T測驗分析這些多態(tài)性標記與TM-1×W10的F2群體的胚性愈傷組織分化率這一性狀之間不具有相關性，尚不能構成單標記。應擴大消減文庫的測序范圍，繼續(xù)尋找與胚性愈傷組織分化率相關的EST-