粉紋夜蛾抗BtCrylAc毒素細(xì)胞與敏感細(xì)胞的差異蛋白初步分析.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringensis)是一種革蘭氏陽性芽孢桿菌，在芽孢形成過程中，可以產(chǎn)生伴孢晶體，這也是其殺蟲的主要活性成分。
　　 Bt合成的殺蟲晶體蛋白或轉(zhuǎn)Bt基因植物表達(dá)的毒素蛋白對多種害蟲具有特異性毒殺作用，被廣泛地用于防治農(nóng)業(yè)和衛(wèi)生害蟲，是環(huán)境友好的生物農(nóng)藥。然而Bt殺蟲晶體蛋白能使害蟲產(chǎn)生高水平的抗性，這Bt資源的可持續(xù)利用有很大影響。因此深入了解昆蟲對Bt的抗性機(jī)制及其特點(diǎn)，才能制定出合理的

2、抗性治理策略，從而降低害蟲抗性的產(chǎn)生。
　　 本文在總結(jié)過去以蘇云金芽孢桿菌工業(yè)制劑篩選培養(yǎng)的離體昆蟲細(xì)胞來研究Bt抗性的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步探討單一的殺蟲晶體蛋白誘導(dǎo)昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生抗性的規(guī)律和深入研究其抗性機(jī)制，我們以在大腸桿菌中表達(dá)的CrylAc毒素連續(xù)處理離體培養(yǎng)的粉紋夜蛾R-Tn－5B1細(xì)胞，目前已獲得一株對CrylAc毒素產(chǎn)生較高抗性的細(xì)胞系，并從細(xì)胞蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步探討了其抗性產(chǎn)生的原因。主要結(jié)果如下：<

3、br>　　 1.CrylAc毒素在大腸桿菌BL21中的轉(zhuǎn)化與表達(dá)
　　 將攜帶有CrylAc編碼基因的重組質(zhì)粒pHT304載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21菌株中，擴(kuò)大培養(yǎng)。將純化的殺蟲晶體蛋白酶和以50mM Na2CO3(pH10.5)溶液降解處理CrylAc毒素對粉紋夜蛾細(xì)胞有毒效。同時含CrylAc晶體編碼基因的大腸桿菌培養(yǎng)物提純殺蟲晶體蛋白，用純化的殺蟲晶體蛋白以堿性溶液降解后經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示，有毒性多肽(

4、MW66 KD左右)的存在。
　　 2.抗性粉紋夜蛾細(xì)胞系(R－Tn－5B1)的篩選及其抗性測定
　　 Tn－5B1細(xì)胞用CrylAc毒素連續(xù)處理，每5代以MTT法測定其抗性上升情況以及抗性粉紋夜蛾細(xì)胞R-Tn－5B1對CrylAc毒素的抗性比，離體生測結(jié)果表明，粉紋夜蛾Tn－5B1細(xì)胞對CrylAc毒素最敏感。第122代抗性衰退細(xì)胞的抗性比為128倍。繼續(xù)篩選到第124代時，抗性持續(xù)增加，抗性比為181.9倍。此后，抗

5、性的發(fā)展出現(xiàn)了一個大幅度的上升，篩選至第127代時抗性比已達(dá)634倍。目前篩選至第130代時抗性一直在增加，抗性比增加至1298.6倍。
　　 3.雙向電泳及圖譜分析
　　 根據(jù)ImageMaster2D Platinum6.0軟件分析，統(tǒng)計了凝膠上所有的差異蛋白點(diǎn)，并初步分析量的差異。分別以粉紋夜蛾敏感細(xì)胞和抗性細(xì)胞總蛋白雙向電泳圖譜和粉紋夜蛾抗CrylAc的R-Tn-5B1細(xì)胞總蛋白雙向電泳圖譜為參照，在抗性細(xì)胞的2

6、-DE總蛋白圖譜上檢測到的差異點(diǎn)主要集中在堿性端和分子量35.0-66.2KD之間且有2000個左右，經(jīng)軟件匹配和人工分析共得到表達(dá)量過量表達(dá)2-4倍的有24個，過量表達(dá)4倍以上的有14個；降低表達(dá)2-4倍有15個，降低表達(dá)4倍以上有18個，其中有顯著差異點(diǎn)有7個。這些差異蛋白質(zhì)可能與Bt抗性的產(chǎn)生存在某種直接或間接的關(guān)系。
　　 4.抗性粉紋夜蛾細(xì)胞和敏感細(xì)胞堿性磷酸酶活性的測定及比較
　　 磷脂酰肌醇錨定的堿性磷酸酶