豬TNF-α單克隆抗體制備與PRRSV感染豬肺泡巨噬細(xì)胞TNF-α變化規(guī)律研究.pdf

1、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,INF-α)是一種主要由活化單核巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的多效性細(xì)胞因子,與全身性炎癥反應(yīng)有關(guān),參與急性期反應(yīng)。TNF-α主要作用于免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié),可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,炎癥反應(yīng),以及抑制腫瘤和病毒的復(fù)制,在疾病感染過程中有重要監(jiān)測意義。
　　 豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratiry Syndrone Viru

2、s,PRRSV)是引起母豬生殖障礙和仔豬呼吸困難的重要病原之一。根據(jù)基因組和抗原性的差異,PRRSV分為歐洲型和美洲型,并存在多種基因亞型,不同分離株毒力差異較大,其致病機(jī)制尚不十分清楚。本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得純化重組TNF-α蛋白,制備獲得其單克隆抗體,并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法和商品化ELISA試劑盒分別檢測PAM感染不同毒力PRRSV后TNF-α變化情況,闡明TNF-α在PRRSV感染過程中的作用。
　　 1.豬TN

3、F-α原核表達(dá)與單克隆抗體制備
　　 根據(jù)豬腫瘤壞死因子α(TNF—α)基因設(shè)計(jì)兩對(duì)引物,利用PCR擴(kuò)增TNF-α成熟蛋白編碼基因(534bp),構(gòu)建原核表達(dá)載體PET-28a-TNF-α,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),SDS-PAGE和Western blotting分析鑒定,證明TNF-A重組蛋白獲得表達(dá)。提取純化該重組蛋白包涵體,免疫BALB/c小鼠,經(jīng)過3次細(xì)胞融合,間接ELISA方法篩選,獲得2株能穩(wěn)定分泌

4、抗豬TNF-α單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞,將其命名為1E2和2F3。Western blotting結(jié)果證明該單克隆抗體能夠與重組蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。間接ELISA測定細(xì)胞上清抗體效價(jià)為分別為1:512,1:1024,腹水效價(jià)均為1:128000,單抗1E2為IgG1亞型,輕鏈為κ型,單抗2F3為IgG3亞型,輕鏈為κ型。雜交瘤細(xì)胞連續(xù)傳代20代,分泌抗體的效價(jià)基本一致,從而為進(jìn)一步建立豬TNF-α的檢測方法奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.

5、PRRSV不同毒株感染豬肺泡巨噬細(xì)胞TNF-α變化規(guī)律比較研究
　　 為了研究豬TNF-α在PRRSV感染中的作用,本研究將高致病性PRRSV分離株SY0608和疫苗弱毒株MLV株分別感染豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM),同時(shí),以LPS(脂多糖)刺激的PAM為陽性對(duì)照,感染后2、4、6、8、10、12、24h采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測PRRSV N蛋白mRNA和TNF-α mRNA,并以管家基因β-actin為內(nèi)參,對(duì)其進(jìn)行相對(duì)定量

6、分析。同時(shí),用豬TNF-α ELISA檢測試劑盒,檢測PAM培養(yǎng)上清中的TNF-α蛋白含量。結(jié)果為:PRRSV感染PAM細(xì)胞后,N蛋白mRNA水平逐漸升高,MLV毒株感染后病毒增殖速度較快,但SY0608毒株感染后24小時(shí),病毒基因轉(zhuǎn)錄水平明顯增高。PAM感染高致病性PRRSV和疫苗弱毒株感染后0-10h,TNF-α mRNA水平呈現(xiàn)上升趨勢,10h后逐漸下降,TNF-α蛋白含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長呈現(xiàn)上升趨勢,高致病性PRRSV感染組T