西瓜玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因及啟動子的克隆與分析.pdf

1、葉黃素循環(huán)存在于所有的高等植物中,是植物在長期進(jìn)化過程中所保存下來的一種代謝過程,其中依賴于葉黃素循環(huán)的熱耗散是最主要的功能,玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因編碼的蛋白是該循環(huán)的兩個(gè)關(guān)鍵酶之一。本研究利用RT-PCR技術(shù)克隆了西瓜玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因CIZE,并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。在此基礎(chǔ)上,利用genome walking克隆了該基因的啟動子。研究結(jié)果如下:
　　 1.通過RT-PCR獲得CIZE基因的cDNA保守區(qū)片段,采用RAC

2、E技術(shù)獲得了西瓜ClZE基因cDNA全長序列。ClZE基因全長2535bp,包含1998bp的開放閱讀框,編碼665個(gè)氨基酸殘基的蛋白。預(yù)測蛋白的分子量大約為73.17KD,理論等電點(diǎn)為7.25,為中性氨基酸?；虻卿浱?HM107775。
　　 2.生物信息學(xué)分析,西瓜ClZE基因編碼的蛋白為穩(wěn)定性蛋白,沒有信號肽,存在一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,含有兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域即Pyr redox superfamily和FHA。
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3、.西瓜ClZE編碼的蛋白在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行同源比對后,進(jìn)行了進(jìn)化樹分析,發(fā)現(xiàn)ClZE保守序列與黃瓜聚為了一大類,其親緣關(guān)系較近。
　　 4.構(gòu)建ClZE基因的原核表達(dá)載體。pET-ClZE在28℃,通過終濃度為1mM的IPTG誘導(dǎo)后,3h時(shí)重組質(zhì)粒出現(xiàn)特異條帶。隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長,誘導(dǎo)特異蛋白表達(dá)量顯著增加,9h后蛋白表達(dá)量最高。SDS-PAGE圖譜顯示得到大約97kDa的誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。
　　 5.采用染色體步移技術(shù)

4、克隆了ClZE基因的啟動子,啟動子的全長為1290bp。分析表明,ClZE啟動子的翻譯起始位點(diǎn)(ATG)上游,含有轉(zhuǎn)錄調(diào)控的保守元件TATA盒和CAAT盒。此外,還有響應(yīng)低溫和光的元件(LTRE1HVBLT49和-10PEHVPSBD)。表明該元件可能介導(dǎo)了ClZE對低溫光的應(yīng)答。
　　 6.利用DNA重組技術(shù),構(gòu)建了融合ClZE啟動子的雙元表達(dá)載體pCAMBIA3301-ClZE-Gus,以及用ClZE不同缺失片段長度報(bào)告基因