硫酸化殼聚糖硒的合成及不同硒源對雞肝細(xì)胞抗氧化功能的影響.pdf

1、試驗一硫酸化殼聚糖硒的有機(jī)合成及鑒定
　　 本試驗通過單因子試驗和正交試驗確定硫酸化殼聚糖硒的最佳合成條件，進(jìn)而應(yīng)用紫外光譜和紅外光譜分析進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。用脫乙酰度為92％的殼聚糖(CTS)3g、二氯乙酸3.5mL、甲酰胺50mL、二甲基甲酰胺(DMF)50mL和氯磺酸10mL，在60℃條件下反應(yīng)2h，合成含硫量為36％的殼聚糖硫酸酯;以殼聚糖硫酸酯為原料，比較殼聚糖硫酸酯與亞硒酸鈉不同pH、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度和質(zhì)量比對硫酸化殼聚

2、糖硒的硒含量和硫含量的影響。結(jié)果顯示，pH為3.0、4.0、5.0、6.0和7.0條件下，制備的硫酸化殼聚糖硒的硒含量分別為8.86±0.05、6.78±0.79、5.51±0.19、6.46±0.68和8.06±0.81mg·g-1，pH3.0組顯著高于pH4.0、5.0和6.0組(P＜0.05);硫含量分別為181.54±3.18、207.43±12.20、221.28±15.96、189.97±35.36和208.93±5.92m

3、g·g-1，pH3.0組顯著低于pH5.0組(P＜0.05)，與其他各組差異不顯著（P＞0.05）。反應(yīng)時間為0.5h、1h、2h、3h和4h條件下，硫酸化殼聚糖硒中硒含量分別為36.50±0.59、33.61±3.08、33.14±2.03、35.34±2.64和32.07±0.63mg·g-1，反應(yīng)0.5h組的硒含量顯著高于4h（P＜0.05），與其他各組差異不顯著（P＞0.05）;硫含量分別為259.81±8.14、264.93±

4、4.27、287.81±12.57、282.24±6.89和279.53±11.79mg·g-1，反應(yīng)0.5h組的硫含量顯著低于2h、3h和4h（P＜0.05）。反應(yīng)溫度為20℃、30℃、40℃、50℃和60℃條件下，硫酸化殼聚糖硒的硒含量分別為41.46±1.34、43.96±0.21、43.07±0.19、42.27±0.36和40.93±1.57mg·g-1，反應(yīng)溫度為30℃組硫含量顯著高于20℃和60℃(P＜0.05);硫含量分

5、別為273.36±10.42、276.22±12.37、276.07±3.85、274.87±12.98和281.79±0.52mg·g-1，各組之間差異不顯著(P＞0.05)。質(zhì)量比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶5和1∶10條件下，硫酸化殼聚糖硒的硒含量分別為75.60±3.38、65.18±1.66、59.44±2.43、54.29±3.05和31.60±1.11mg·g-1,質(zhì)量比高的組顯著高于低質(zhì)量比組(P＜0.05);硫含量分

6、別為213.68±0.97、229.15±0.91、236.87±1.98、232.57±2.52和254.74±2.09mg·g-1，質(zhì)量比為1∶1組的硫含量顯著低于其他各組(P＜0.05)。利用正交試驗對單因子試驗進(jìn)一步優(yōu)化，對硫酸化殼聚糖硒進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，證實硫酸酯基與硒酯基已經(jīng)成功結(jié)合到了CTS上，并且沒有破壞殼聚糖硫酸酯單元上的官能團(tuán)或者破壞糖環(huán)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，硫酸化殼聚糖硒合成的最佳反應(yīng)條件為:質(zhì)量比為1∶1殼聚糖硫酸酯與亞硒

7、酸鈉，在40℃和pH3.0的條件下反應(yīng)45min，制備出36.01～39.21mg·g-1硒含量和213.81～232.76mg·g-1硫含量的硫酸化殼聚糖硒。
　　 試驗二硫酸化殼聚糖硒對雞肝細(xì)胞抗氧化功能的影響
　　 本試驗采用膠原酶灌注消化法分離雞肝臟細(xì)胞，用臺盼藍(lán)拒染法測定肝細(xì)胞即時存活率，以每孔8×105個肝細(xì)胞的量接種于牛尾膠原包被的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，在培養(yǎng)液中添加0（對照）、0.5、1.5、和5

8、μmol·L-1殼聚糖硒、硫酸化殼聚糖硒、亞硒酸鈉（以硒計）和1、3、10mg·L-1殼聚糖硫酸酯、CTS（以硒計對應(yīng)的CTS量），培養(yǎng)24h后取細(xì)胞上清液和細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白濃度、抗超氧陰離子(Anti-superoxideanion，O2-)活性、總抗氧化能力（Totalantioxidantcapacity，T-AOC）和谷胱甘肽(Glutathione，GSH)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)、過氧化物酶(Peroxi

9、dase，POD)的測定。結(jié)果顯示，CTS組和對照組GSH活性顯著低于其他各組(P＜0.05)，0.5和1.5μmol·L-1硫酸化殼聚糖硒組顯著高于5μmol·L-1組(P＜0.05)，與其他各組差異不顯著（P＞0.05）;5μmol·L-1硫酸化殼聚糖硒組上清POD活性與0.5和1.5μmol·L-1亞硒酸鈉組差異不顯著（P＞0.05），顯著高于其他各組(P＜0.05);0.5μmol·L-1亞硒酸鈉和1mg·L-1殼聚糖硫酸酯組T

10、-AOC活性顯著高于其他各組(P＜0.05)，CTS組和對照組T-AOC活性顯著低于其他各組(P＜0.05);5μmol·L-1殼聚糖硒抗超氧陰離子活性顯著高于其他各組(P＜0.05)，同濃度的硫酸化殼聚糖硒組與亞硒酸鈉組抗超氧陰離子活性差異不顯著(P＞0.05);1.5μmol·L-1殼聚糖硒與0.5μmol·L-1亞硒酸鈉組CAT活性顯著高于其他各組(P＜0.05)，硫酸化殼聚糖硒組CAT活性隨硒濃度的增大而增大，亞硒酸鈉組CAT活

11、性隨硒濃度的增大而減小，對照組CAT活性均顯著低于其他各組(P＜0.05)。結(jié)果表明，硫酸化殼聚糖硒能顯著提高肝細(xì)胞中各種抗氧化因子的活性，具有較好的抗氧化作用，效果優(yōu)于CTS、殼聚糖硫酸酯和殼聚糖硒。
　　 試驗三硫酸化殼聚糖硒對GPx1和GPx4mRNA表達(dá)的影響
　　 雞單層原代肝細(xì)胞用0、0.5、1.5和5μmol·L-1（以硒計）殼聚糖硒、硫酸化殼聚糖硒、亞硒酸鈉和1、3和10mg·L-1（以硒計對應(yīng)的CTS量

12、）殼聚糖硫酸酯和CTS培養(yǎng)液孵育培養(yǎng)24h，檢測肝細(xì)胞中細(xì)胞性谷胱甘肽過氧化酶(GPx1)和磷脂氫谷胱甘肽過氧化酶(GPx4)mRNA的表達(dá)量。結(jié)果顯示，0.5和5μmol·L-1硫酸化殼聚糖硒組GPx1mRNA表達(dá)量顯著高于其他組(P＜0.05)，0.5μmol·L-1殼聚糖硒和1.5μmol·L-1硫酸化殼聚糖硒組GPx1mRNA表達(dá)量顯著高于亞硒酸鈉、CTS和空白對照組（P＜0.05），殼聚糖硫酸酯和CTS組GPx1mRNA表達(dá)量

13、與對照組差異不顯著（P＞0.05）;0.5μmol·L-1硫酸化殼聚糖硒組GPx4mRNA表達(dá)量顯著高于其他組（P＜0.05），1.5μmol·L-1硫酸化殼聚糖硒組GPx4mRNA表達(dá)量顯著高于亞硒酸鈉組(P＜0.05)，殼聚糖硫酸酯和CTS組與對照組GPx4mRNA表達(dá)量之間差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，硒是影響肝細(xì)胞GPx1和GPx4mRNA表達(dá)的主要因素，硫酸化殼聚糖硒對GPx1和GPx4mRNA表達(dá)量的作用效果優(yōu)于殼聚