重組牛分枝桿菌ESAT6-CFP10蛋白在牛病診斷及細(xì)胞活性中的應(yīng)用研究.pdf

1、牛結(jié)核病是一種主要由牛型分枝桿菌引起的慢性消耗性人獸共患傳染病，該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為B類(lèi)疫病，其傳播流行影響著全球畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展及人類(lèi)的健康。目前牛結(jié)核病臨床檢測(cè)的主要方法是PPD皮膚變態(tài)反應(yīng)，但是PPD與環(huán)境中其它分枝桿菌存在交叉反應(yīng)，導(dǎo)致檢測(cè)的特異性降低。ESAT6/CFP10是存在于致病性分枝桿菌中的優(yōu)勢(shì)抗原，其能引起動(dòng)物感染早期的細(xì)胞免疫，但是在BCG疫苗株與禽結(jié)核分枝桿菌株中則沒(méi)有這種基因編碼，由此本研究選擇

2、ESAT6/CFP10作為臨床診斷牛結(jié)核病的目的抗原以提高檢測(cè)的特異性。
　　以牛結(jié)核分枝桿菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到目的基因，并克隆至pET32a(+)表達(dá)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，隨后將其轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，得到45kd大小的蛋白。Western blot證實(shí)，重組蛋白具有良好的生物活性。Ni-NTA金屬離子親和層析得到純化的目的蛋白。利用ESAT6/CFP10與牛型提純結(jié)核菌素(PPD-B)對(duì)5

3、0頭假定健康奶牛進(jìn)行臨床對(duì)比檢測(cè)，結(jié)果表明，ESAT6/CFP10組的陽(yáng)性結(jié)果與PPD-B組的符合率為84.2％;利用ESAT6/CFP10和PPD-B作為刺激原進(jìn)行IFN-γ釋放試驗(yàn)的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，ESAT6/CFP10組的復(fù)檢結(jié)果與PPD-B組的符合率為86.7％。由此可見(jiàn)，ESAT6/CFP10在牛結(jié)核病臨床診斷中有較好的表現(xiàn)。
　　為了進(jìn)一步探索ESAT6/CFP10對(duì)靶細(xì)胞（巨噬細(xì)胞）活性的潛在影響，本研究制備了負(fù)

4、載重組質(zhì)粒pEGFP-N1-ESAT6/CFP10的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞(NR8383)，經(jīng)1 ug/ml G418篩選，獲得了穩(wěn)定表達(dá)的巨噬細(xì)胞系。用WST-1法測(cè)定ESAT6/CFP10對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明，10ug/ml ESAT6/CFP10對(duì)NR8383的增殖雖有明顯的抑制作用，但卻對(duì)負(fù)載目的基因的細(xì)胞系的生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用;用Griess法測(cè)定ESAT6/CFP10對(duì)巨噬細(xì)胞生成NO能力的影響，結(jié)果表明，ESAT6/C